Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca 2 + Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme
Summary
Burada elektrofizyoloji ve Ca2 + görüntüleme için uygun agar-gömülü retina dilim hazırlanması için bir protokol. Bu yöntem, tek presinaptik sinir uçları doğrudan patch-klemp kayıtları kullanarak retina mikrodevreler şerit-tip sinaps bir çalışma sağlar.
Abstract
Görsel uyaranlar, gözdeki uzman nöronların ışık yoğunluğu ve frekans değişimleri, geniş bir dinamik aralık üzerinden tespit edilir ve iletilir. Retina nöronlar, fotoreseptör ve bipolar hücreleri iki sınıf, uzun süreler boyunca sürekli ve yüksek verimli nörotransmitter sürümü sağlayan şerit tip aktif bölgeleri, kullanarak gerçekleştirmek. Goldfish retina ışık uyaranlara depolarize ve karma çubuk ve koni fotoreseptör giriş ON-tipi karma bipolar hücre (Mb) terminalleri, büyük boyutları nedeniyle her iki şerit tip sinaps (~ 10-12 çalışma için uygundur mikron çaplı) ve amacrine hücre dendritler ile çok sayıda yanal ve karşılıklı sinaptik bağlantıları. Goldfish yama klemp tekniği ile retina dilim Mb bipolar hücre terminalleri doğrudan erişim presinaptik Ca 2 ölçümünü sağlar + akımları, membran kapasitans değişiklikleri ve GABA aracılı karşılıklı sinaptik geribildirimle engelleme <alt> A ve GABA C reseptörleri terminallerinde dile getirdi. Ekzositoz presinaptik membran kapasitans ölçümleri bir eksitatör nörotransmitter sürümü 14,15 kısa vadeli plastisite çalışma izin verir. Buna ek olarak, kısa vadeli ve uzun vadeli plastisite amacrine hücrelerinden inhibitör nörotransmitter salınımı Mb terminali 21 gelen karşılıklı geribildirimle engelleme kayıtları incelenmiştir. Amacrine hücreleri GABAerjik karşılıklı geribildirimle engelleme süresi (örneğin ~ 10 sn) kısa süre içinde, GABA vezikül havuzu tükenmesi 11 ile eşleştirilmiş nabız depresyon uğrar. Retinanın iç pleksiform tabakası retina mikrodevreler sinaptik dinamikleri dolayısıyla doğrudan incelenebilir.
Beyin-dilim tekniği, 40 yılı aşkın önce tanıtıldı ama hala çok nöronların elektriksel özellikleri, hem tek hücreli soma, tek dendrit ve akson soruşturma için yararlı ve microcircuit sinaptik düzeyde 19. Doğrudan dilimleme odasının üzerine yapıştırılmış olması çok küçük dokular genellikle ilk agar gömülü (ya da bir filtre kağıdı yerleştirilir) ve sonra 20, 23, 18, 9 dilimlenmiş. Bu video, goldfish retina kullanarak ön gömme agar tekniği kullanmaktayız. Bazı goldfish retinanın dilim dev bipolar hücre terminalleri dilimleme işlemi sırasında axotomized (akson-cut). Bu axotomized terminallerinden kayıt soma-dendritik bölmesi sinyalleri hariç tutması nedeniyle, tek presinaptik sinir terminal girişleri izole etmek için izin verir. Alternatif olarak, bir de dilimleme işlemi sırasında kesilmiş aksonların bağlı terminallerinden kaydederek, sağlam Mb bipolar hücrelerin kaydedebilirsiniz. Genel olarak, bu deneysel protokol kullanımı sinaptik fizyolojisi, retina mikrodevreler fonksiyonel analiz, ve şerit sinaps sinaptik iletim çalışmaları yardımcı olacaktır.
Protocol
Discussion
Protokolünde kritik ve zor bir adım agar solüsyonu (protokol 3.4) retina parça transferi . Retina parça vitreus mizah ve artık dilim çözüm dikkatlice çıkarın ve bozulma veya bükmeden aktarmak için gereklidir. Bunu başarmak için, biz, bir ucu retina pozisyonu için açılı ucu forseps (11.251-35, Güzel Bilim Araçları) ile birlikte, 90 ° açı oluşturacak şekilde eğildi küçük bir spatula (21-401-25b, Fisherbrand) dilim çözüm transfer süreci boyunca parçası. Retina dilim ve…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz laboratuarımızda protokolü kullanarak başladığı agar gömülü retina dilim hazırlık yaptığı tür bir açıklama için teşekkür ederim Dr. Fred Rieke. Ayrıca resimde şematik bakış ve Dr Lori Vaskalis teşekkür ederim. Metin ve video hakkında faydalı yorumlar için Veeramuthu Balakrishnan ve Soyoun Cho. Bu çalışma bir NEI-NIH RO1 hibe ile desteklenen ve aynı zamanda kısmen Kore Hükümeti tarafından finanse edilen bir Kore Araştırma Vakfı Hibe Programı tarafından desteklenen [KRF-2008-357-E00032].
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Low gelling-temperature agar | Sigma | A0701 | Agarose type VII-A |
| Patch pipette | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
| Vertical puller | Narishige | PP830 | |
| Dental wax | Cavex | ||
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| 45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Razor blade | Personna | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
| Cylindrical tube | Fisherbrand | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1000S or VT1200S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| 60x water-immersion objective | Olympus | LUMPlanFl | NA 0.90 |
| CCD camera | Sony | XC-75 | |
| Camera controller | Hamamatsu | C2400 | |
| Monitor | Sony | 13” black and white monitor | |
| Syringe filter | Nalgene | 0.2 μm | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-200 | |
| Lock-in amplifier | HEKA | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
| Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
| Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffer solution | GIBCO | 70013 | |
| Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
| Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-25B | |
| Manuel vertical slicer | Narishige | ST-20 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
| Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |
Referências
- Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson’s disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
- WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . Active ageing: a policy framework. , (2002).
- Schapira, A. H. Movement disorders: advances in cause and treatment. Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).
- Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson’s disease: problems with the current model. Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).
- Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).
- Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).
- Hanrieder, J. Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).
- Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).
- Ljungdahl, . Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson’s Disease. PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).
- Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).
- Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).
- Deininger, S. -. O., Setou, M. . Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).
- Norris, J. L. Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis. Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).
- Ihaka, R., Gentleman, R. R. A Language for Data Analysis and Graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).
- Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. . Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).
- Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
- Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P. Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).
- Falth, M. Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides. Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).
- Falth, M. a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).
