Summary

Patch-clamp Mått kapacitans och Ca 2 + Imaging vid enstaka nervterminaler i näthinnan Slices

Published: January 19, 2012
doi:

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för beredning av agar inbäddade-retinal skivor som är lämpliga för elektrofysiologi och Ca2 + avbildning. Denna metod gör att man kan studera band-typ synapser i näthinnan mikrokretsar med direkt patch-clamp inspelningar av enstaka presynaptiska nervändslut.

Abstract

Visuella stimuli upptäcks och förmedlas över ett brett dynamiskt omfång av ljusintensiteter och förändringar ofta av specialiserade nervceller i ryggradsdjur näthinnan. Två klasser av näthinnans nervceller, fotoreceptorer och celler bipolär, åstadkomma detta genom att använda band-typ aktiva zoner, som möjliggör uthållig och hög genomströmning frisättningen av neurotransmittorer under långa tidsperioder. ON-typ blandad bipolär cell (Mb) terminaler i guldfisk näthinnan, som depolarize till ljus stimuli och får blandas tappar och stavar photoreceptor ingång, är lämpliga för studier av band-typ synapser både på grund av sin storlek (~ 10-12 ìm diameter) och deras många sidled och ömsesidiga synapsförbindelser med amakrina cell dendriter. Direkt tillgång till MB bipolär cell terminaler i Goldfish retinal skivor med patch-clamp teknik möjliggör mätning av presynaptiska Ca 2 + strömmar, membran förändringar kapacitans, och ömsesidig synaptiska feedback-hämning medierad av GABA <sub> A och GABA C-receptorer uttrycks på terminalerna. Presynaptiska membranet kapacitans mätningar av exocytos tillåter en att studera den kortsiktiga plasticitet i excitatoriska neurotransmittorn släppa 14,15. Dessutom kan kortsiktiga och långsiktiga plasticitet i inhibitoriska neurotransmittorn befrielse från amakrina celler också utredas av inspelningar av ömsesidig återkoppling hämning anländer till Mb plint 21. Under korta perioder (t.ex. ~ 10 s), genomgår GABAergic ömsesidig återkoppling hämning från amakrina celler parade puls depression via GABA vesikler poolen utarmning 11. Den synaptiska dynamik retinal mikrokretsar i den inre plexiform lagret av näthinnan kan därför vara direkt studeras.

Hjärnan-slice tekniken infördes mer än 40 år sedan men är fortfarande mycket användbar för undersökning av de elektriska egenskaperna hos nervceller, både på det enda cell soma, enkel Dendrite eller axon, och microcircuit synaptisk nivå 19. Vävnader som är för små för att limmas direkt på skivning kammaren ofta först inbäddade i agar (eller placeras på ett filtrerpapper) och sedan skivade 20, 23, 18, ​​9. I denna video använder vi före inbäddning agar teknik med guldfiskar näthinnan. Några av de gigantiska bipolära cellen terminaler i våra skivor av guldfisk näthinnan är axotomized (axon-cut) under skärning förfarandet. Detta tillåter oss att isolera enstaka presynaptiska ingångar nervändslut, eftersom inspelning från axotomized terminaler utesluter signalerna från soma-dendritiska facket. Alternativt kan en post även från intakta Mb bipolära celler, genom att spela in från depåer knutna till axoner som inte har sänkts under skivning förfarandet. Totalt sett kommer att använda denna experimentella protokoll stöd i studierna av näthinnans synaptiska fysiologi, mikrokrets funktionell analys och synaptisk transmission på band synapser.

Protocol

1. Externa och interna lösningar Förbered skivning lösning (lågt kalcium) från 10x stamlösningen och tillsätt MgCl 2, CaCl 2, och D-glukos dagligen. Den slutliga 1x Lösningen består av (i mm): 119 NaCl, 2,5 KCl, 3,2 MgCl 2, 0,25 CaCl 2, 12 D-glukos, 0,2 L-askorbinsyra, 12 HEPES. Ställ pH till 7,4 (med NaOH) och justera osmolalitet till 260 mOsm (med H 2 O och 10x stamlösning). Väg upp 3% låg gelbildande temperatur agar (agaros typ V…

Discussion

Ett kritiskt och svårt steg i våra protokoll är överföring av del av näthinnan i agar lösningen (protokoll 3,4). Det är nödvändigt att noggrant avlägsna glaskroppen och återstående skiva lösning från retinala pjäsen och den överförs utan förvrängning eller böjning. För att åstadkomma detta använder vi en liten spatel (21-401-25B, Fisherbrand) med en spets böjd att bilda en 90 ° vinkel, tillsammans med vinklad spets pincett (11.251-35, Fine Science Tools), att placera näthinnan…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Dr Fred Rieke för hans vänliga förklaring av agar inbäddade-retinal slice förberedelser när vi började använda protokollet i vårt laboratorium. Vi tackar också Lori Vaskalis för illustration av schematisk överblick och Dr. Veeramuthu Balakrishnan och Soyoun Cho för värdefulla kommentarer på texten och video. Detta arbete stöddes av ett NEI-NIH RO1 bidrag, och var också delvis av en Korea Research Foundation som finansieras av Sydkoreas regering [KRF-2008-357-E00032].

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Low gelling-temperature agar Sigma A0701 Agarose type VII-A
Patch pipette World Precision Instruments 1B150F-4 Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass
Vertical puller Narishige PP830  
Dental wax Cavex    
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08  
45° angled fine tip forceps Fine Science Tools 11251-35  
Razor blade Personna   Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O
Cylindrical tube Fisherbrand 03-338-1B Polyethylene sample vials 2.5 ml
Hyaluronidase Sigma H6254  
Vibratome slicer Leica VT1000S or VT1200S  
Upright microscope Olympus BX51WI  
60x water-immersion objective Olympus LUMPlanFl NA 0.90
CCD camera Sony XC-75  
Camera controller Hamamatsu C2400  
Monitor Sony   13” black and white monitor
Syringe filter Nalgene   0.2 μm
Micromanipulator Sutter Instrument MPC-200  
Lock-in amplifier HEKA   EPC-9/10 amplifiers have software emulation
Spinning disk laser confocal microscope Yokogawa CSU-X1 Live cell imaging after patch clamp whole cell recording
Slidebook software Intelligent Imaging Instruments (3i)   Imaging data acquisition and analysis
Paraformaldehyde Sigma P6148  
Phosphate buffer solution GIBCO 70013  
Superfrost slide Fisher Scientific   Slide glass
Anti-fading agents Biomeda corp.    
Confocal laser-scanning microscope Carl Zeiss LSM 710 Imaging of fixed tissue
Spatula Fisherbrand 21-401-25B  
Manuel vertical slicer Narishige ST-20  
Oregon Green 488 BAPTA-1 Invitrogen O-6806 Ca2+ sensitive fluorescent dye
Alexa Fluor 555 Hydrazide Invitrogen A-20501MP Fluorescent dye

Referências

  1. Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
  2. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  3. Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson’s disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
  4. WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . Active ageing: a policy framework. , (2002).
  5. Schapira, A. H. Movement disorders: advances in cause and treatment. Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).
  6. Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson’s disease: problems with the current model. Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).
  7. Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).
  8. Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).
  9. Hanrieder, J. Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).
  10. Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).
  11. Ljungdahl, . Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson’s Disease. PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).
  12. Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).
  13. Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).
  14. Deininger, S. -. O., Setou, M. . Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).
  15. Norris, J. L. Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis. Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).
  16. Ihaka, R., Gentleman, R. R. A Language for Data Analysis and Graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).
  17. Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. . Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).
  18. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
  19. Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P. Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).
  20. Falth, M. Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides. Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).
  21. Falth, M. a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).
check_url/pt/3345?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Kim, M., Vickers, E., von Gersdorff, H. Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices. J. Vis. Exp. (59), e3345, doi:10.3791/3345 (2012).

View Video