Summary

Patch-clamp Kapasitans Målinger og Ca 2 + Imaging ved Singel nerveterminaler i Retinal Slices

Published: January 19, 2012
doi:

Summary

Her beskriver vi en protokoll for utarbeidelse av agar-embedded retinal skiver som er egnet for elektrofysiologi og Ca2 + bildebehandling. Denne metoden gjør det mulig å studere bånd-type synapser i retinal microcircuits bruke direkte patch-clamp opptak av single presynaptiske nerveterminaler.

Abstract

Visuelle stimuli er oppdaget og formidlet over et bredt dynamisk spekter av lys intensitet og frekvens endres med spesialisert nevroner i virveldyr netthinnen. To klasser av netthinnens nerveceller, fotoreseptorene og bipolare celler, oppnår dette ved hjelp av bånd-type aktive soner, som muliggjør vedvarende og høy gjennomstrømning nevrotransmitter utgivelse over lange tidsperioder. ON-typen blandet bipolar celle (Mb) terminaler i gullfisk netthinnen, som depolarize til lys stimuli og motta blandet stang og kjegle fotoreseptoren innspill, er egnet for studiet av bånd-type synapser både på grunn av sin store størrelse (~ 10-12 mikrometer diameter), og deres tallrike lateral og gjensidige synaptiske forbindelser med amacrine celle dendritter. Direkte tilgang til Mb bipolar celle terminaler i gullfisk retinal skiver med patch-clamp teknikken tillater måling av presynaptisk Ca 2 + strømmer, membran kapasitans endringer, og gjensidig synaptisk feedback-hemming mediert av GABA <sub> A og GABA C reseptorer uttrykt på terminalene. Presynaptisk membran kapasitans målinger av eksocytose tillate en å studere den kortsiktige plastisitet av eksitatoriske nevrotransmitter utgivelsen 14,15. I tillegg kan kortsiktige og langsiktige plastisitet av inhibitoriske nevrotransmitter løslatelse fra amacrine celler også bli etterforsket av innspillinger av gjensidige tilbakemeldinger hemming ankommer Mb terminal 21. Over korte perioder av gangen (f.eks ~ 10 s), gjennomgår gabaergic gjensidig feedback-hemming fra amacrine celler parvise puls depresjon via GABA vesicle bassenget uttømming 11. Den synaptiske dynamikk retinal microcircuits i indre plexiform laget av netthinnen kan dermed være direkte studert.

Hjernen-slice teknikk ble introdusert mer enn 40 år siden, men er fortsatt svært nyttig for etterforskningen av de elektriske egenskapene til nevroner, både på enkelt celle soma, single dendrite eller axon, og microcircuit synaptiske nivå 19. Vev som er for små til å være limt direkte på slicing kammeret er ofte første innebygd i agar (eller plasseres på et filter papir) og deretter skiver 20, 23, 18, ​​9. I denne videoen, ansetter vi pre-embedding agar teknikk med gullfisk netthinnen. Noen av de gigantiske bipolar celle terminaler i vår skiver av gullfisk netthinnen er axotomized (axon-cut) under kutting prosedyren. Dette gir oss muligheten til å isolere enkelt presynaptisk nerve terminal innganger, fordi opptak fra axotomized terminaler utelukker signalene fra de soma-dendrittiske kupé. Alternativt kan man også ta opp fra intakt Mb bipolare celler, med opptak fra terminaler festet til axoner som ikke har blitt kuttet under kutting prosedyren. Totalt sett vil bruk av denne forsøksprotokollen hjelpemiddel i studier av retinal synaptic fysiologi, microcircuit funksjonell analyse, og synaptisk overføring på bånd synapser.

Protocol

1. Ekstern og intern Solutions Forbered slicing løsning (lav kalsium) fra 10x stamløsning og tilsett 2 MgCl, CaCl 2, og D-glukose daglig. Den endelige 1x Løsningen består av (i mm): 119 NaCl, 2,5 KCl, 3.2 2 MgCl, 0,25 CaCl 2, 12 D-glukose, 0,2 L-askorbinsyre, 12 HEPES. Sett pH til 7,4 (med NaOH), og juster osmolaritet til 260 mOsm (med H 2 O og 10x stamløsningen). Vei opp 3% lav gelling temperatur agar (agarose type VII-A, A0701, Sigma, Rie…

Discussion

En kritisk og vanskelig skritt i protokoll vårt er overføring av del av netthinnen inn i agar løsningen (protokoll 3.4). Det er nødvendig å forsiktig fjerne glasslegemet og rester slice løsning fra retinal stykke og overføre det uten forvrengning eller bøyd. For å oppnå dette bruker vi en liten slikkepott (21-401-25B, Fisherbrand) med et tips bøyd i en 90 ° vinkel, sammen med vinklet spiss tang (11251-35, Fine Science Tools), å plassere retinal stykke gjennom overføringsprosessen i skive l…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. Fred Rieke for hans slags forklaring av agar-embedded retinal slice forberedelse da vi begynte å bruke protokollen i vårt laboratorium. Vi takker også Lori Vaskalis for illustrasjon av skjematisk oversikt og Drs. Veeramuthu Balakrishnan og Soyoun Cho for nyttige kommentarer til tekst og video. Dette arbeidet ble støttet av en NEI-NIH RO1 stipend, og var også delvis støttet av en Korea Research Foundation Grant finansiert av den koreanske regjeringen [KRF-2008-357-E00032].

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Low gelling-temperature agar Sigma A0701 Agarose type VII-A
Patch pipette World Precision Instruments 1B150F-4 Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass
Vertical puller Narishige PP830  
Dental wax Cavex    
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08  
45° angled fine tip forceps Fine Science Tools 11251-35  
Razor blade Personna   Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O
Cylindrical tube Fisherbrand 03-338-1B Polyethylene sample vials 2.5 ml
Hyaluronidase Sigma H6254  
Vibratome slicer Leica VT1000S or VT1200S  
Upright microscope Olympus BX51WI  
60x water-immersion objective Olympus LUMPlanFl NA 0.90
CCD camera Sony XC-75  
Camera controller Hamamatsu C2400  
Monitor Sony   13” black and white monitor
Syringe filter Nalgene   0.2 μm
Micromanipulator Sutter Instrument MPC-200  
Lock-in amplifier HEKA   EPC-9/10 amplifiers have software emulation
Spinning disk laser confocal microscope Yokogawa CSU-X1 Live cell imaging after patch clamp whole cell recording
Slidebook software Intelligent Imaging Instruments (3i)   Imaging data acquisition and analysis
Paraformaldehyde Sigma P6148  
Phosphate buffer solution GIBCO 70013  
Superfrost slide Fisher Scientific   Slide glass
Anti-fading agents Biomeda corp.    
Confocal laser-scanning microscope Carl Zeiss LSM 710 Imaging of fixed tissue
Spatula Fisherbrand 21-401-25B  
Manuel vertical slicer Narishige ST-20  
Oregon Green 488 BAPTA-1 Invitrogen O-6806 Ca2+ sensitive fluorescent dye
Alexa Fluor 555 Hydrazide Invitrogen A-20501MP Fluorescent dye

Referências

  1. Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
  2. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  3. Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson’s disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
  4. WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . Active ageing: a policy framework. , (2002).
  5. Schapira, A. H. Movement disorders: advances in cause and treatment. Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).
  6. Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson’s disease: problems with the current model. Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).
  7. Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).
  8. Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).
  9. Hanrieder, J. Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).
  10. Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).
  11. Ljungdahl, . Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson’s Disease. PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).
  12. Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).
  13. Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).
  14. Deininger, S. -. O., Setou, M. . Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).
  15. Norris, J. L. Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis. Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).
  16. Ihaka, R., Gentleman, R. R. A Language for Data Analysis and Graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).
  17. Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. . Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).
  18. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
  19. Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P. Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).
  20. Falth, M. Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides. Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).
  21. Falth, M. a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).
check_url/pt/3345?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Kim, M., Vickers, E., von Gersdorff, H. Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices. J. Vis. Exp. (59), e3345, doi:10.3791/3345 (2012).

View Video