Patch-clamp Kapacitans Målinger og Ca 2 + Imaging på Single nerveterminaler i Retinal Skiver
Summary
Her beskriver vi en protokol for forberedelse af agar-embedded retinal skiver, der er egnet til elektrofysiologi og Ca2 + billeddannelse. Denne metode gør det muligt at studere bånd-typen synapser i retina mikrokredsløb med direkte patch-clamp optagelser af en enkelt præsynaptiske nerveender.
Abstract
Visuelle stimuli opfanges og transporteres over et bredt dynamisk område af lys intensitet og frekvens ændringer af specialiserede neuroner i hvirveldyr nethinden. To klasser af retinale neuroner, fotoreceptorer og bipolære celler, opnå dette ved hjælp af bånd-typen aktive zoner, der gør det muligt vedvarende og high-throughput neurotransmitter release over lange perioder. ON-typen blandet bipolar celle (Mb) terminaler i guldfisk nethinden, som depolarisere for lys stimuli og modtage blandet stang og kegle fotoreceptor input, er egnet til studiet af bånd-typen synapser både på grund af deres store størrelse (~ 10-12 μm diameter) og deres talrige laterale og gensidige synaptiske forbindelser med amacrine celle dendritter. Direkte adgang til Mb bipolar celle terminaler i Goldfish retinal skiver med patch-clamp teknik giver mulighed for måling af præsynaptiske Ca 2 + strømme, membran kapacitans ændringer, og gensidig synaptic feedback hæmning medieret af GABA <sub> A og GABA C receptorer udtrykt på terminalerne. Præsynaptisk membran kapacitans målinger af exocytose tillader en at studere på kort sigt plasticitet excitatoriske neurotransmitter release 14,15. Derudover kan kortsigtede og langsigtede plasticitet hæmmende neurotransmitter frigivelse fra amacrine celler også blive undersøgt af optagelser af gensidige feedback hæmning ankommer til Mb terminalen 21. Over kortere perioder (fx ~ 10 s), undergår GABAergic gensidig feedback hæmning fra amacrine celler parret-puls depression via GABA vesikel pool udtynding 11. Den synaptisk dynamik retinal mikrokredsløb i den indre plexiform lag af nethinden kan således direkte undersøgt.
Hjernen-slice teknik blev indført mere end 40 år siden, men er stadig meget nyttigt for undersøgelsen af de elektriske egenskaber af neuroner, både på enkelt celle soma, enkelt dendritceller eller Axon, og microcircuit synaptiske niveau 19. Væv, der er for lille til at være limet direkte på udskæring kammer ofte er de første indlejret i agar (eller placeres i et filter papir) og derefter skåret 20, 23, 18, 9. I denne video beskæftiger vi før forankring agar teknik med guldfisk nethinden. Nogle af de gigantiske bipolar celle terminaler i vores skiver af guldfisk nethinden er axotomized (Axon-klip) under udskæring procedure. Dette giver os mulighed for at isolere en enkelt præsynaptiske nerve terminal indgange, fordi optagelse fra axotomized terminaler udelukker signalerne fra soma-dendritiske rum. Alternativt kan man også optage fra intakte Mb bipolare celler, ved at optage fra terminaler knyttet til axoner, som ikke er skåret under udskæring procedure. Samlet set vil anvendelsen af denne forsøgsplan støtte i studier af retinale synaptisk fysiologi, mikrokredsløb funktionel analyse, og synaptisk transmission på bånd synapser.
Protocol
Discussion
En kritisk og vanskeligt skridt i vores protokol er overførslen af det stykke af nethinden i agar opløsning (protokol 3.4). Det er nødvendigt omhyggeligt at fjerne glaslegemet og resterende skive løsning fra den retinale brik og overføre det uden forvrængning eller bøjes. For at opnå dette, bruger vi en lille spatel (21-401-25B, Fisherbrand) med en spids bøjet til at danne en 90 ° vinkel, sammen med vinklet spids pincet (11251-35, Fin Science Tools), at placere den retinale brik i hele overfø…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Fred Rieke for hans venlige forklaring på agar-embedded retinal skive forberedelse, da vi begyndte at bruge protokollen i vores laboratorium. Vi takker også Lori Vaskalis til illustration af skematisk overblik og Drs. Veeramuthu Balakrishnan og Soyoun Cho for nyttige kommentarer til tekst og video. Dette arbejde blev støttet af en NEI-NIH RO1 tilskud, og var også delvist støttet af en Korea Research Foundation Grant finansieret af den koreanske regering [KRF-2008-357-E00032].
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Low gelling-temperature agar | Sigma | A0701 | Agarose type VII-A |
| Patch pipette | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
| Vertical puller | Narishige | PP830 | |
| Dental wax | Cavex | ||
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| 45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Razor blade | Personna | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
| Cylindrical tube | Fisherbrand | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1000S or VT1200S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| 60x water-immersion objective | Olympus | LUMPlanFl | NA 0.90 |
| CCD camera | Sony | XC-75 | |
| Camera controller | Hamamatsu | C2400 | |
| Monitor | Sony | 13” black and white monitor | |
| Syringe filter | Nalgene | 0.2 μm | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-200 | |
| Lock-in amplifier | HEKA | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
| Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
| Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffer solution | GIBCO | 70013 | |
| Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
| Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-25B | |
| Manuel vertical slicer | Narishige | ST-20 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
| Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |
Referências
- Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson’s disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
- WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . Active ageing: a policy framework. , (2002).
- Schapira, A. H. Movement disorders: advances in cause and treatment. Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).
- Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson’s disease: problems with the current model. Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).
- Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).
- Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).
- Hanrieder, J. Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).
- Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).
- Ljungdahl, . Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson’s Disease. PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).
- Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).
- Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).
- Deininger, S. -. O., Setou, M. . Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).
- Norris, J. L. Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis. Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).
- Ihaka, R., Gentleman, R. R. A Language for Data Analysis and Graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).
- Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. . Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).
- Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
- Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P. Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).
- Falth, M. Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides. Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).
- Falth, M. a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).
