التصحيح ، المشبك قياسات السعة والكالسيوم 2 + التصوير في محطات عصب واحد في شرائح الشبكية
Summary
نحن هنا وصف بروتوكول لإعداد آغار جزءا لا يتجزأ من شرائح الشبكية التي هي مناسبة للالكهربية وCA2 التصوير +. هذا الأسلوب يسمح احد لدراسة الشريط من نوع المشابك في شبكية العين باستخدام رقائق مباشرة التصحيح ، المشبك تسجيلات احد المحطات العصبية قبل المشبكي.
Abstract
تم الكشف عن المثيرات البصرية ونقل أكثر من مجموعة واسعة ديناميكية من شدة الضوء وتيرة التغيرات التي الخلايا العصبية المتخصصة في شبكية الفقاريات. طبقتين من الخلايا العصبية للشبكية ، وخلايا المستقبلات الضوئية بين القطبين ، وتحقيق ذلك عن طريق استخدام شريط من نوع المناطق النشطة ، والتي تتيح سرعة عالية مستمرة والافراج عن العصبي على مدى فترات زمنية طويلة. ON – نوع من الخلايا المختلطة بين القطبين (MB) محطات ذهبية في الشبكية ، مما يزيل الاستقطاب للمؤثرات الضوء وتلقي قضيب المختلط وإدخال المخروط مبصرة ، هي مناسبة لدراسة الشريط من نوع المشابك على حد سواء نظرا لحجمها الكبير (10-12 ~ قطرها ميكرون) ، وعلاقاتهم عديدة متشابك الأطراف ومتبادلة مع التشعبات الخلية عديم الاستطالات. الوصول المباشر إلى محطات ميغابايت القطبين في الخلية شرائح ذهبية الشبكية مع تقنية التصحيح ، المشبك يسمح قياس الكالسيوم قبل المشبكي 2 + التيارات والتغيرات السعة الغشاء ، وردود الفعل المتبادلة تثبيط متشابك بوساطة GABA <وأعرب الفرعي> مستقبلات GABA A و C على المحطات. قبل المشبكي قياسات السعة غشاء إيماس تسمح لأحد لدراسة اللدونة قصيرة الأجل لإطلاق ناقل عصبي مثير 14،15. بالإضافة ، يمكن أيضا اللدونة قصيرة الأجل وطويلة الأجل لإطلاق النواقل العصبية من الخلايا المثبطة يكون عديم الاستطالات التي حققت فيها تسجيلات لتثبيط ردود فعل متبادلة وصوله الى محطة ميجا 21. على مدى فترات قصيرة من الوقت (على سبيل المثال ~ 10 ق) ، وردود الفعل المتبادلة GABAergic تثبيط من خلايا عديمة المحوار يخضع إقران النبض الاكتئاب غابا عن طريق حويصلة استنفاد تجمع 11. وبالتالي يمكن لديناميات متشابك من رقائق في طبقة الشبكية ضفيري الداخلية للشبكية دراستها مباشرة.
تم إدخال تقنية شريحة الدماغ أكثر من 40 عاما لكنها ما زالت مفيدة جدا للتحقيق في الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية ، سواء على سوما خلية واحدة ، تغصن واحد أو محور عصبي ، ومicrocircuit مستوى متشابك 19. وغالبا ما تكون الأنسجة التي هي صغيرة جدا بحيث لا يمكن لصقها مباشرة على غرفة تشريح مضمن الأولى في أجار (أو وضعها على ورقة فلتر) وشرائح ثم 20 ، 23 ، 18 ، 9. في هذا الفيديو ، ونحن توظيف تقنية آغار قبل التضمين باستخدام الشبكية ذهبية. وaxotomized بعض المحطات العملاقة في القطبين خلية لدينا شرائح للشبكية ذهبية (محوار قطع) خلال إجراء تشريح. وهذا يسمح لنا محطة واحدة لعزل العصب قبل المشبكي المدخلات ، وذلك لأن التسجيل من المحطات axotomized يستبعد إشارات من المقصورة ، سوما شجيري. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أيضا تسجيل خلايا سليمة من القطبين ميغابايت ، من خلال تسجيل من محطات ملحقة المحاور التي لم يتم خفض أثناء إجراء تشريح. عموما ، سوف تستخدم هذا البروتوكول التجريبي المساعدات في دراسات علم وظائف الأعضاء متشابك شبكية العين ، والتحليل الوظيفي المتناهية الصغر ، وانتقال متشابك في نقاط الاشتباك العصبي الشريط.
Protocol
Discussion
وثمة خطوة حاسمة وصعبة في بروتوكول لدينا هو نقل قطعة من شبكية العين في حل آغار (بروتوكول 3.4). فمن الضروري إزالة بعناية والفكاهة الزجاجي حل شريحة المتبقية من قطعة الشبكية ونقلها دون تحريف أو الانحناء. من أجل تحقيق هذا الهدف ، ونحن نستخدم ملعقة صغيرة (21 – 401 – 25B ، Fis…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور فريد Rieke لتفسير الرقيقة للأجار جزءا لا يتجزأ من إعداد شريحة الشبكية عندما بدأنا باستخدام بروتوكول في مختبرنا. كما نشكر لوري Vaskalis لتوضيح نظرة تخطيطية والدكاترة. Veeramuthu بالاكريشنان وتشو Soyoun للحصول على تعليقات مفيدة حول النص والفيديو. وأيد هذا العمل عن طريق منحة RO1 NEI – NIH ، وكان أيضا دعما جزئيا من خلال منحة مؤسسة كوريا للبحوث التي تمولها الحكومة الكورية [KRF – 2008 – 357 – E00032].
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Low gelling-temperature agar | Sigma | A0701 | Agarose type VII-A |
| Patch pipette | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
| Vertical puller | Narishige | PP830 | |
| Dental wax | Cavex | ||
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| 45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Razor blade | Personna | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
| Cylindrical tube | Fisherbrand | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1000S or VT1200S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| 60x water-immersion objective | Olympus | LUMPlanFl | NA 0.90 |
| CCD camera | Sony | XC-75 | |
| Camera controller | Hamamatsu | C2400 | |
| Monitor | Sony | 13” black and white monitor | |
| Syringe filter | Nalgene | 0.2 μm | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-200 | |
| Lock-in amplifier | HEKA | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
| Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
| Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffer solution | GIBCO | 70013 | |
| Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
| Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-25B | |
| Manuel vertical slicer | Narishige | ST-20 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
| Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |
Referências
- Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson’s disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
- WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . Active ageing: a policy framework. , (2002).
- Schapira, A. H. Movement disorders: advances in cause and treatment. Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).
- Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson’s disease: problems with the current model. Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).
- Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).
- Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).
- Hanrieder, J. Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).
- Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).
- Ljungdahl, . Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson’s Disease. PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).
- Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).
- Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).
- Deininger, S. -. O., Setou, M. . Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).
- Norris, J. L. Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis. Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).
- Ihaka, R., Gentleman, R. R. A Language for Data Analysis and Graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).
- Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. . Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).
- Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
- Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P. Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).
- Falth, M. Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides. Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).
- Falth, M. a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).
