のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

1。 P.のマウスモデル緑膿菌 GI植民地化と普及 C3H/HeNマウス（雌、6〜8週齢の古い、ハーラン）が共生細菌叢を破壊する経口抗生物質で処理し、以前に4を説明するようにしてPAとのモノは、植民地化されています。 2。ネズミ盲腸管腔内容物を収穫液体窒素槽に洗浄ステンレス鋼モルタルを浸す。 二酸化炭素の窒息によりマウスを安楽死させる。 発泡スチロールのボードおよび95％エタノールでシャワー上のセキュリティで保護されたマウスの死骸。胸骨から会陰部への皮膚を通して正中縦切開を加えます。腹腔を露出する皮膚と腹膜を反映している。 全体盲腸を切除する。ステンレス鋼モルタル以上鉗子で盲腸を保持する。解剖はさみで盲腸の両端をスニップ。 盲腸の近位端に盲腸flushate緩衝液（10mM TrisHCl、1mMのEDTA、200 mMのNaCl）5 1mlで満たしたP1000ピペットの先端を挿入します。ステンレス製の乳鉢に盲腸flushateバッファおよび盲腸内腔の内容をフラッシュします。盲腸flushate緩衝液1mlは、盲腸内容物のすべてをフラッシュするための十分です。盲腸flushateの内容は、モルタルと接触した時点で直ちに凍結されます。 滅菌乳棒で盲腸flushateの内容を挽く。 場所の地面には、ドライアイス/エタノール浴に浸漬50 mlのポリプロピレンコニカルチューブに盲腸管腔内容物を凍結。 繰り返して、各追加のマウスは2.7を介して2.2を繰り返します。 -80℃で保存する 3。細菌のRNAの単離 65にパラフィルムで固定されたキャップで50mlオークリッジ遠心管に含まれる酸の暖かい1ボリューム（二盲腸内腔の内容を、約3 mlの最終容量に基づいて）フェノール/クロロホルム（5:1、v / v）を℃の水浴。 溶解バッファーの沸騰0.5体積（2％SDS、16 mMのEDTA、200 mMのNaCl）6は、5分間に50 mlのポリプロピレンコニカルチューブに含まれています。 盲腸内腔の内容に沸騰溶解バッファーを追加します。ホモジナイズ。周期的にボルテックスしながら5分間沸騰させます。 65 ° Cの酸オークリッジ遠心管にフェノール/クロロホルムを100 ° C盲腸内容物/溶解サンプルを追加。パラフィルムでシールキャップ。 65℃でインキュベートC定期的なボルテックス（2分毎）で10分間。 15分間4℃で2500グラムで、サンプルを遠心する。 慎重に新鮮な50ミリリットルオークリッジ遠心機に水相を（白のインターフェースのいずれかを避けて）転送する。水相の体積は、盲腸内容物、溶解バッファー、および酸性フェノール/クロロホルムの総体積の約50％になります。フェノール酸/等量のクロロホルムを追加。 シールは、パラフィルムでキャップとハイスピー​​ドでボルテックスでよく混ぜる。 15分間4℃で2500グラムで、サンプルを遠心する。 水相および有機相の間に目に見える白のインタフェースがなくなるまで3.9から3.7までのステップを繰り返します。 慎重に新鮮な50ミリリットルオークリッジ遠心機に水相を移す。クロロホルム/イソアミルアルコール（24:1、v / v）の等量を追加。 シールは、キャップとボルテックスでよく混和する。 15分間4℃で2500グラムで、サンプルを遠心する。 15 mlのポリプロピレンコニカルチューブに水相を（ボリュームは総反応容量の約50％となる）を外し、イソプロパノールの等量を追加。 少なくとも2時間または一晩のために-20℃でインキュベートする。 45分間、4℃で2500グラムで、サンプルを遠心する。ペレット状のゲルは、チューブの底に形成されます。上清を取り除く。 氷冷70％エタノール1mlでペレットを洗浄します。渦。 5分間、4℃で10,000 gででサンプルを遠心分離します。 上清を除去し、室温で10分間ペレット乾燥をさせるためにチューブを反転させる。 RNaseフリー水200μlのRNAペレットを再懸濁します。 4。 DNase処理（ターボDNA -フリー、アプライドバイオシステムズ） 10XターボのDNaseバッファーおよび2μlのターボのDNase20μlを加え、穏やかに混ぜる。 20分間37℃でインキュベートする。 再懸濁したのDNase不活化試薬20μlを加え、よく混ぜる。 時々混ぜ、室温で5分間インキュベートする。 1.5分間、室温で10,000 gで遠心し、新しいマイクロ遠心チューブに上清を移す。 フェノール/クロロホルム冷（4℃）酸の1つのボリュームを追加し、1分間ボルテックスでよく攪拌します。 2分間、室温で12500グラムで遠心。 新しいチューブに水相を移し、クロロホルム/イソアミルアルコール（49:1 v / v）で、渦の1ボリュームを追加します。 2分間、室温で12500グラムで遠心。 新しいチューブに水相（総反応容量の約50％）を譲渡。 3Mの酢酸ナトリウムの0.1倍量、pHが5.5を追加します。氷冷100％エタノールを2.5倍量。渦。 -20℃で少なくとも2時間または30分間-80℃でインキュベートする。 4℃で30分間12,000 gで遠心する° 上清を取り除く。 4℃で10,000 gで5分間、遠心分離することにより、氷冷70％エタノール1mlでペレットを洗浄します。 10分間上清と空気乾​​燥を取り外します。 RNaseフリー水100μlにペレットを再懸濁します。懸濁するために65℃の水浴中に配置し、ペレットを溶解するために必要な場合があります。 DNase処理の有効性をテストするには、リボソームタンパク質（または他の参照の遺伝子）の増幅のための標準的なRT – PCR反応は、RTはコントロールを使用しないで、処理および非処理サンプルに対して実行される可能性があります。 5。 RNAのクリーンアップステップ（キアゲン、RNeasyキット） キアゲン社RNeasyミニハンドブック（ 第 4版、2006年4月）のページ56から57を参照してください。示されているように従ってください。 6。代表的な結果このプロトコルを使用して、復元された細菌のトータルRNAの量は、2つのcecumsから約2〜3μgのです。回収したRNAは、その後の定量PCR、転写プロファイリング、およびRNAのSeqの実験のための十分な量と品質です。 RNAの純度は、日常的にサンプルの260nm/280nm比7を測定することにより評価、まだこの方法では、RNAの完全性に関する情報を提供されていません。アジレントバイオアナライザは、サイジング、定量化とDNA、RNA、タンパク質や細胞の品質管理のためのマイクロ流体ベースのプラットフォームであり、RNAの完全性番号（RIN）8として知られているRNAの完全性のメトリックを利用しています。このプロトコルで抽出されたRNAは、280分の260 1.7から2.0に至るまでの比率とRINの値≥7.0を生成します。このプロトコルによって回復細菌のRNAのアジレントバイオアナライザ分析の一例を図1に示されています。 図1。アジレントバイオアナライザ電気泳動図と緑膿菌のトータルRNAサンプルのゲル状のイメージが分離し、マウス盲腸内容物から回収。 RIN 8.0。