Biz insan nöronal atalarıdır ve sinir onarımı için gelişmekte olan MSS nöronal hücre tipleri büyük bir arz türetme sağlayan küçük moleküller ile tanımlanan koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan neuroblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.
Onarım veya rejenerasyon hasarlı santral sinir sistemi (MSS) yapısı ve günümüz sağlık sektöründe devresi için klinik olarak uygun insan nöronal hücre kaynağı için büyük bir karşılanmamış ihtiyaç vardır. Hücre bazlı tedaviler CNS rahatsızlıkları için kayıp bir sinir dokusu ve işlevi geri yüklemek için büyük umutlar tutun. Ancak, MSS elde edilen sinir kök hücreleri üzerinde hücre tedavileri arz kısıtlaması ve klinik ortamda kullanılmak üzere sınırlı genişleme yeteneği, geniş Pasajlanması 1-3 sonra kültür ve başarısız plastisite nedeniyle zorluk yaşadık . CNS-kökenli insan sinir kök hücrelerinin (hNSCs) bazı yararlı sonuçlara rağmen, trofik ve nöroprotektif molekülleri ile endojen hücreler 1-3 kurtarmak için öncelikle bunların non-nöronal yavrularıyla terapötik etkiler görünmektedir. Alternatif olarak, nörolojik bozukluklar supplyin geniş bir yelpazede pluripotent insan embriyonik kök hücreleri (hESC) teklif tedavilerig rejenerasyon 1,4-7 için gelişmekte olan MSS insan nöronal hücre tiplerinin çeşitliliği. Ancak, istenen bir fenotip pluripotent hESC geniş bir farklılaşma potansiyelinin verimli ve öngörülebilir bir kanal nasıl gelişim çalışma ve klinik çeviri için önemli bir sorun olmuştur. Geleneksel yaklaşımlar genellikle fenotipik heterojenite ve istikrarsızlık, dolayısıyla Tümör Gelişimi 7-10 riski yüksek takip verimsiz ve kontrol edilemeyen bir soy-taahhüt, pluripotent hücrelerin spontan germ tabakası farklılaşma ile çok soyundan eğim güveniyor . Buna ek olarak, tanımsız / yabancı hayvan biyolojik takviyeleri ve / veya 11-13 sorunlu hastalarda hücre uzman greftler genellikle izolasyon, genişleme ve farklılaşma hESC için kullanılan besleyiciler doğrudan yararlanabilirler. Bu engelleri aşmak için, biz gerekli ve yeterli s için belirli bir kültür sistemi elemanları çözmüşhESC epiblast pluripotence ustaining klinik uygun hESC de novo türetme için bir platform olarak hizmet veren ve etkili bir şekilde küçük moleküller 14 (Şekil şematik bir bakın 1) tarafından klinik olarak ilgili soy doğru düzgün gibi hESC yönetmenlik. Retinoik asit (RA), bakımı, besleyiciler 1, 14 farklılaşmamış hESC nöronal farklılaşma yol açmaz. Ve fare EKH aksine, sadece biraz hESC diferansiye embriyoid organları (EBS) tedavisinde nöronlar 1, 14, 15 düşük verim artar. Ancak, küçük moleküller ve büyüme faktörleri çeşitli tarama sonrasında, söz konusu tanımlanmış koşullar retinoik asit (RA), daha fazla insan nöronal atalarıdır ve nöronların neuroblasts ilerledikçe pluripotent hESC doğrudan neuroectoderm belirlenmesine ikna etmek için yeterli hale bulundu yüksek verimlilik ile gelişmekte olan santral sinir sistemi (Şekil 2) . Biz nöro indüksiyonu için koşulları tanımlanmışpluripotent hESC insan nöronal hücrelerin hücre tabanlı tedavi için gelişim evreleri yelpazesinde büyük bir arz-kontrollü verimli türetme sağlayan bir multi-dizi embriyoid vücut sahne olmadan, doğrudan patlamalar.
Gelişimsel çalışma ve klinik çeviri için en büyük zorluklardan biri, verimli ve öngörülebilir bir insan pluripotent kök hücrelerinin istenen bir fenotip geniş bir farklılaşma potansiyeli nasıl kanal olmuştur. Bütün germ hücrelerine in vitro olarak bu hücreleri çok soyundan agrega sahne geçiyor kendiliğinden ayırt rağmen, hücrelerin yalnızca küçük bir bölümünü belirli bir soy 1,4 sürdürmektedirler. Bu hESC kaynaklı agrega, eş zamanlı görünümü birbirinden çok farklı üç embriyonik germ ikamet istenmeyen hücre tiplerinde önemli bir miktarı genellikle verimsiz sadece istenilen fenotipleri ortaya çıkması yapar, ancak kontrol edilemeyen ve güvenilmez olarak iyi. Ancak, kalp ve sinir soy önceki raporlar elde olmasına rağmen, pluripotent hücreler mikrop tabakası-indüksiyon ve Tümör Gelişimi yüksek risk ile özel hücreler üreten verimsizlik transplantatio aşağıdakin ileri klinik çeviri engellemiştir.
HESC hatları başlangıçta büyüme tutuklandı fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) 4 ile elde edilen ve ko-kültür muhafaza edildi. HESC 11-13, çeşitli insan besleyici, besleyici ve kimyasal formüle kültür sistemleri için geliştirilmiş olmasına rağmen, insan pluripotent hücrelerin kendini yenileme sürdürülmesi için gerekli ve yeterli elemanları çözümsüz kalır . Bu eksojen besleyici hücreleri ve biyolojik reaktifler farklılaşmamış hESC uzun vadeli istikrarlı bir büyüme maske ise pluripotent hücrelerin gelişim sinyalleri cevap yeteneğini korumaya yardımcı. Farklılaşmamış hESC sadık genişleme ve kontrol edilebilir doğrudan farklılaşma sağlayan tanımlanmış bir biyolojik-kültür sistemi bakımı, terapötik programı ve potansiyel anahtarlarından biridir. RA önceden bildirilen Condit altında tutulan farklılaşmamış hESC nöronal farklılaşma ikna etmek için yeterli değildieksojen besleyici hücreler içeren iyonları. HESC diferansiye çok soyundan agrega (embriyoid organları) RA tedavisinde, sinir soy hESC farklılaşmasında nispeten erken bir aşamada görünmesine rağmen sadece biraz nöronlar 1, 14, 15 düşük verim arttı. Belirli bir soydan insan pluripotent kök hücrelerinin düzgün bir dönüşüm elde etmek için, biz, sadece klinik olarak ilgili soy belirli bir pluripotent hESC iyi kontrollü verimli indüksiyonu için koşulları tanımlamak için farklılaşmamış hESC yayılması sigortalanması yeteneğine tanımlanmış bir kültür sistemi istihdam küçük moleküllerin basit bir hükmün (Şekil 1, Şekil 2) . Gelecek çalışmalar, alternatif olarak rejeneratif tedaviler için klinik ile ilgili soy kaynaklanan küçük molekül aracılı hESC pluripotent kaderini doğrudan kontrolü ve modülasyon için önünü olabilir insan santral sinir sistemi gelişiminde genetik ve epigenetik kontrolü moleküller ortaya koyacaktır. RA tedavisinde, 1-5 olmadan% HESC nöronlar 1, 14, 15 spontan bir farklılaşma uğrayacaktır . RA tedavi ile, insan embriyonik gelişimi 14 taklit edebilecek bir süreç tanımlamak kültürün etkisi altında muhafaza hESC>% 95 embriyonik nöronal atalarıdır ve nöronlar oluşturmak mümkün olmuştur. Son zamanlarda, genlerin belirlenmesinde bilinen sinirsel kaderi 0.5-8% 17, 18 kadar düşük bir verimlilik ile yetişkin sinir atalarıdır ve nöron içine fare fibroblastlar transdifferentiate kullanılmıştır. Ancak, reprogrammed somatik hücre tarihsel anormal gen ekspresyonu ve engelli terapötik yarar 19-21 ile hızlandırılmış yaşlanması ile ilişkili olmuştur. Son olarak, burada kurulan protokol, iç hücre kütlesinden (ICM) veya insan blastosist 4 epiblast elde edilen pluripotent hESC sınırlı morula önceki edilen hayvansal kaynaklı EKH, EKH (sekiz dahil olmak üzere diğer pluripotent hücreler için geçerli olmayabilir -cell)-dönem embriyoların 22 ve artificially reprogrammed hücreler 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP, Ulusal Sağlık (NIH), Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIHK01AG024496) ve Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (NIHR21HD056530) hibe Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
all-trans-Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565018 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Human BDNF | PeproTech | AF-450-02 | |
Human VEGF | PeproTech | AF-100-20 | |
Human NT-3 | PeproTech | 450-03 | |
Heparin | Sigma | H5284 | |
N-2 supplement (100X) | Invitrogen | 17502048 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |