Hemos establecido un protocolo para la inducción de los neuroblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de progenitores neuronales humanos y los tipos de células neuronales en el desarrollo del SNC para la reparación neural.
Hay una gran necesidad insatisfecha de un clínicamente adecuado de las células neuronales de origen humano, para la reparación o regeneración de los daños del sistema nervioso central (SNC) la estructura y los circuitos en la industria actual de la salud. Terapias basadas en células son una gran promesa para restaurar el tejido nervioso y la función de pérdida para los trastornos del sistema nervioso central. Sin embargo, las terapias basadas en células en el SNC derivan las células madre neurales se han encontrado con restricción de la oferta y la dificultad para utilizar en la práctica clínica debido a su capacidad de expansión limitada de la cultura y la plasticidad no después de un extenso 1-3 pases. A pesar de algunos resultados beneficiosos, en el sistema nervioso central derivado de las células madre humanas neuronales (hNSCs) parecen ejercer sus efectos terapéuticos principalmente por su no neuronales a través de progenies tróficos producción y moléculas neuroprotectoras para rescatar a las células endógenas 1-3. Por otra parte, pluripotentes células madre embrionarias humanas (hESCs) ofrecer la cura para una amplia gama de trastornos neurológicos por supplying de la diversidad de tipos de células neuronales humanas en el desarrollo del SNC para la regeneración de 1,4-7. Sin embargo, la forma de encauzar el potencial de diferenciación gama de hESCs pluripotentes de manera eficiente y previsible a un fenotipo deseado ha sido un gran reto tanto para el estudio del desarrollo y la traducción clínica. Los enfoques convencionales se basan en múltiples linajes de células pluripotentes inclinación a través de la diferenciación espontánea capa germinal, dando lugar a ineficiencia e incontrolable linaje compromiso de que a menudo es seguida por la heterogeneidad fenotípica y la inestabilidad, por lo tanto, un alto riesgo de carcinogénesis 07.10. Además, sin definir los suplementos biológicos extranjeros / animal y / o alimentadores que han sido tradicionalmente utilizados para el aislamiento, la expansión y diferenciación de hESCs puede hacer uso directo de tales células especializadas injertos en pacientes con problemas 11-13. Para superar estos obstáculos, hemos resuelto los elementos de un sistema de cultivo definido necesaria y suficiente para sustaining la pluripotence epiblasto de hESCs, sirviendo como una plataforma para la derivación de novo de hESCs clínicamente adecuado y eficaz dirección de hESCs tal manera uniforme hacia linajes clínicamente relevantes por pequeñas moléculas 14 (véase un esquema en la Fig. 1.). El ácido retinoico (RA) no induce la diferenciación neuronal de hESCs indiferenciada mantiene en los alimentadores 1, 14. Y a diferencia de los CES del ratón, el tratamiento de células madre diferenciadas-cuerpos embrioides (EBS) sólo aumenta ligeramente el bajo rendimiento de las neuronas 1, 14, 15. Sin embargo, después de evaluar una variedad de pequeñas moléculas y factores de crecimiento, se encontró que tales condiciones definidas prestados ácido retinoico (RA) es suficiente para inducir a la especificación de neuroectodermo directa de hESCs pluripotentes que más progresó a los neuroblastos que generó humanos progenitores neuronales y neuronas en el SNC en desarrollo con alta eficiencia (Fig. 2). Hemos definido las condiciones para la inducción de neuroexplosiones directas de hESCs pluripotentes sin la intervención de múltiples etapas linaje cuerpo embrioides, lo que permite un buen control de derivación eficiente de una gran cantidad de células neuronales humanas en todo el espectro de las etapas del desarrollo de terapias basadas en células.
Uno de los mayores desafíos tanto para el estudio del desarrollo y la traducción clínica ha sido la forma de encauzar el potencial de diferenciación gama de pluripotentes células madre humanas a un fenotipo deseado de manera eficiente y predecible. A pesar de estas células pueden diferenciarse espontáneamente in vitro en células de todas las capas germinales por pasando por una etapa de agregado de varios linajes, sólo una pequeña fracción de las células de perseguir un 1,4 linaje dado. En los agregados de células madre derivadas-, la aparición simultánea de una cantidad considerable de tipos de células muy divergentes no deseados que pueden residir en tres capas germinales embrionarias a menudo hace que la aparición de fenotipos deseados no sólo ineficiente, sino incontrolable y poco fiable así. A pesar de los linajes cardíacos y neurales se han obtenido en los informes anteriores, sin embargo, la ineficiencia en la generación de células especializadas a través de la capa germinal de la inducción de células pluripotentes y el alto riesgo de carcinogénesis siguientes transplantation han dificultado la traducción de otro ensayo clínico.
La líneas de células madre inicialmente se derivaron y mantenerse en co-cultivo con fibroblastos de ratón de crecimiento arrestado embrionarias (MEFs) 4. Aunque varias de alimentación humana, alimentación libre-, y químicamente formulado sistemas de cultivo se han desarrollado para hESCs 11-13, los elementos necesarios y suficientes para el sostenimiento de la auto-renovación de las células pluripotentes humanas siguen sin resolverse. Estas células alimentadoras exógenos y reactivos biológicos ayudan a mantener el crecimiento estable a largo plazo de hESCs indiferenciada, mientras que la máscara de la capacidad de las células pluripotentes para responder a las señales de desarrollo. El mantenimiento de hESCs indiferenciada en un sistema de cultivo definido biológicos sin que permite la expansión y diferenciación de fieles directa controlable es una de las claves de su utilidad terapéutica y potenciales. RA no era suficiente para inducir la diferenciación neuronal de hESCs indiferenciada mantenido bajo Condit previamente informadoiones que contienen células exógenas de alimentación. A pesar de los linajes neuronales aparecen en una etapa relativamente temprana en la diferenciación de células madre, el tratamiento de células madre diferenciadas-multi-linaje de los agregados (cuerpos embrioides) con AR sólo aumentó ligeramente el bajo rendimiento de las neuronas 1, 14, 15. A fin de lograr de manera uniforme la conversión de las células madre pluripotentes a un linaje particular, se empleó un sistema de cultivo definido capaz de asegurar la proliferación de hESCs indiferenciada para identificar las condiciones para un buen control de inducción eficiente de hESCs pluripotentes exclusivamente a un determinado linaje clínicamente relevantes por la simple provisión de pequeñas moléculas (Fig. 1, fig. 2). Los estudios futuros se muestran las moléculas de control genético y epigenético en el desarrollo del sistema nervioso central humano como alternativa, lo que puede allanar el camino para pequeñas moléculas mediada por el control directo y la modulación de las células madre pluripotentes destino al derivar linajes clínicamente relevantes para las terapias regenerativas. RA sin tratamiento, 1-5HESCs% se someterá a la diferenciación espontánea en neuronas 1, 14, 15. Con el tratamiento de la AR, hemos sido capaces de generar> 95% de los progenitores neuronales y neuronas embrionarias de hESCs mantenido bajo una cultura de definir en un proceso que podría emular el desarrollo de embriones humanos 14. Recientemente, se conoce el destino neural-la determinación de los genes se han utilizado para transdiferenciarse fibroblastos de ratón en adultos progenitores neuronales y neuronas con una baja eficiencia que van desde 0,5 hasta 8% 17, 18. Sin embargo, la reprogramación de células somáticas han sido históricamente asociada con la expresión del gen anormal y la senescencia acelerada con la utilidad terapéutica deterioro 19-21. Finalmente, el protocolo se estableció aquí se limita a hESCs pluripotentes derivadas de la masa celular interna (ICM) o epiblasto del blastocisto humano 4, no puede aplicarse a las células pluripotentes, incluyendo CES animal se originó, derivados de los CES a principios de mórula (ocho de las células) en fase de embriones, 22 y ArtifLas células reprogramadas icially 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP ha sido apoyado por el Instituto Nacional de Salud (NIH) subvenciones del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIHK01AG024496) y el Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (NIHR21HD056530).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
all-trans-Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565018 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Human BDNF | PeproTech | AF-450-02 | |
Human VEGF | PeproTech | AF-100-20 | |
Human NT-3 | PeproTech | 450-03 | |
Heparin | Sigma | H5284 | |
N-2 supplement (100X) | Invitrogen | 17502048 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |