小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

1。ソリューションとメディアの準備ゼラチンコーティング溶液：4で0.1％（w / v）ののddH 2 O、オートクレーブでゼラチンと店舗℃のマトリゲルコーティングソリューション。ストック溶液：° C一晩、10mlの氷冷DMEMまたはDMEM/F12を追加、よく混ぜて、アリコートを1ml /滅菌組織培養フードの下にチューブ、-20℃で保存します。4でゆっくりと解凍マトリゲル（10ml）をワーキングソリューション：遅い雪解け4で1ミリリットルマトリゲルのアリコート° C DMEMまたはDMEM/F12を冷やして14ミリリットルまで1-2時間、転送およびコーティングの直前に滅菌組織培養フードの下によく混ぜる。 人間のラミニンコーティング溶液：希釈1ミリリットルのヒトラミニン溶液を氷冷DMEMまたはDMEM/F12へと（トリスでは0.5 mg / mlの-80店舗、NaClをバッファ° C、1〜2時間、4℃でゆっくりと解凍） 12.5ミリリットルワーキング溶液（40μg/ ml）を滅菌​​組織培養フードの下にすぐにコーティングの前に。 成長因子のストック溶液（500 – 1000X）：10μgのに成長因子を溶かす滅菌緩衝液に/ mlの（0.5％BSA、1.0mMのDTT、10％グリセロール、1XPBS）と-80℃で50〜100μL/チューブアリコートなどの店舗℃までオールトランスレチノイン酸ワーキングソリューション（1000X）：DMSO中の10mM、-80℃でアリコートの店舗℃に hESCのメディア：DMEM/F12またはKO – DMEM（80％）、KO血清の交換（20％）、L -アラニル- L – GLNまたはL – GLN（2 mM）を、MEM非必須アミノ酸（MNAA、1X）、およびβ-メルカプトエタノール（100μM）、フィルタリングして4℃で保存、使用前に20 ng / mlのbFGFを補充したC、。または定義されたコンポーネントで、"（KO）血清代替物をノックアウト"交換：DMEM/F12またはKO – DMEM（100％）、L -アラニル- L – GLNまたはL – GLN（2 mM）を、MNAA（1X）、MEM不可欠アミノ酸（MEAA、1X）、およびβ-メル​​カプトエタノール（100μM）は、濾過し、4℃のbFGF（20 ng / ml）を、ヒトインスリン（20μg/ ml）を、アスコルビン酸（濃度50μg/を添加したC、使用前にml）を、人間のアクチビンA（50 ng / ml）を、（10 mg / ml）をAlbumax /ヒトアルブミン、およびヒトトランスフェリン（8μg/ mlの）。 NSCメディア：DMEM/F12（100％）、N – 2 supplemeNT（1X）、ヘパリン（8μg/ mlの）。 2。プレートコーティングゼラチンでコートプレートは6ウェルプレートにゼラチン溶液を2.5ml /ウェルを追加し、37℃の加湿インキュベーターで一晩インキュベートする。 コー​​トのラミニンとプレート：チルゼラチンコートプレートとゼラチン削除は、2.5 mlを追加/予備冷却にもマトリゲルまたはヒトラミニンコーティングワーキングソリューションは、4℃で一晩6ウェルプレートとインキュベートしてゲル化。 3。定義された条件の下で未分化ヒトES細胞を継代し、シーディングヒトES細胞のコロニー5-7日齢に成長できるように、と解剖顕微鏡（プリウォーム37に段階を解剖° C）滅菌フードを解剖下にヒトES細胞培養プレートを取る。 ヒトES細胞のコロニーを分割する]を選択します。形態学的に、これらのコロニーは、定義されたエッジ国連に通常わずかに不透明> 75％未分化ヒトES細胞を（小さなコンパクト細胞）、（白積み重ねではない細胞ではなく、明確な分化細胞）が必要です解剖顕微鏡をderneath。慎重に選択したコロニーを概説し、コロニーと、すべての差別化された部品をP2滅菌ピペットチップのエッジを持つコロニーの（もしあれば）またはガラスキャピラリーを引っ張っ周囲の差別化された線維芽細胞の層を取り除く。 （解剖顕微鏡による100％未分化な、> 75％が未分化は通常、通過点として考えられている優先するものの、これを知る論文の細胞に難しい、さらに最適な条件下で自発的な分化を受け、人工多能性ヒトESが一時的な段階にある、注意してください。分化した細胞は通常、シードされず、継代過程で除去、成長を続ける） 吸引することで、浮動戸分化細胞を含む古いメディアを削除します。かつてhESCのメディア（bFGFを除く）で洗浄する。 3ミリリットル/ウェル20 ng / mlのbFGFを含む新鮮なhESCのメディアを追加します。 小片に未分化ヒトES細胞のコロニーを切断し、滅菌ピペットチップを使用してデタッチまたはガラスキャピラリーを引っ張った。 50 mlコニカルチューブに一緒に分離されたコロニーの部分を含むメディアプール。を1ml /一緒に20 ng / mlのbFGFおよびプールを含むだけでなくhESCのメディアで一回プレートを洗浄してください。 コー​​ティングされた新鮮なプレートからマトリゲルまたはヒトラミニン液を吸引除去する。 6ウェルプレートにコロニーの部分を含むアリコート4ミリリットル/よくhESCのメディア。静かに振盪せずに培養器にプレートを転送し、5％CO 2の雰囲気で加湿37℃のインキュベーターを乱すことなく一晩コロニーピースシードを許可する。 4。レチノイン酸で定義された培養システムの下でヒトESの神経誘導播種後3日目に、プレートの各ウェルから古いメディアのほとんどを削除し、ヒトES細胞のコロニーは、（ヒトES細胞が乾燥しても決して許さない）浸水することを許可するのに十分なメディアを残す。 20 ng / mlのbFGFおよび10μMのレチノイン酸を含む4ミリリットル/よく新鮮なhESCのメディアと交換してください。 20 ng / mlのbFGFを含む新鮮なhESCのメディアと古いメディアを交換し、10μMのレチノイン酸一日おきに、と神経誘発性hESCのコロニーは、7日または8に成長することができます。コロニー内のすべてのセルは、乗算を続ける大規模な分化細胞に形態変化を受けることになる。コロニーは、7日または8でプレートをカバーする大きさで増加し、細胞がコロニーのいくつかの分野で積み上げを開始します。 5。浮遊培養での継続的な神経分化滅菌フードを解剖下に解剖顕微鏡（37〜プリ暖かい解剖段階° C）へのヒトES細胞培養プレートを取る。慎重にコロニーを概説し、P2滅菌ピペットチップのエッジでコロニーを取り巻く線維芽細胞の層（分化した細胞がコロニー外に移行）を削除したり、ガラスが管を引っ張った。 吸引することで、浮動戸線維芽細胞を含む古いメディアを削除します。かつてhESCのメディア（bFGFを除く）で洗浄する。 3ミリリットル/ウェルの新鮮なhESCのメディア（bFGFをせずに）を追加します。 カット神経- I細かくnduced hESCのコロニー、および滅菌ピペットチップを使用してデタッチまたはガラスキャピラリーを引っ張った。 50 mlコニカルチューブに一緒に分離されたコロニーの部分を含むメディアプール。一緒に1ミリリットル/ウェルhESCのメディア（bFGFを除く）と、プールで一回プレートを洗浄してください。 分注し4ミリリットル/よく4〜5日間を形成する浮遊細胞のクラスターを（神経芽細胞）を許可するには、37℃加湿インキュベーター中、6ウェル超低取付板とインキュベートしてコロニーの部分を含む無血清hESCのメディア。 6。接着培養におけるニューロン表現型の成熟 50 mlコニカルチューブに一緒にフローティング神経芽細胞を含むメディアプール。 5分、1400 rpmで遠心する。あなたができる限り古い培地を吸引除去し、VEGF（20 ng / ml）を、NT – 3（10 ng / mlの）、およびBDNF（10 ng / ml）を含有する新鮮なNSCメディアの同量を追加します。 4ミリリットル/ウェル、6ウェルプレートにフローティング神経芽細胞と一定量を混合するために上下にピペッティングし。神経芽細胞はまた、SEになることができるラミニン/コラーゲン（マトリゲル）またはヒトラミニン重合VEGF（20 ng / ml）を、NT – 3（10 ng / mlの）、およびBDNF（10 ng / ml）を含む無血清NSCメディアにおける3次元マトリックスでeded 。神経芽細胞は一晩アタッチできるように37℃の加湿インキュベーターにプレートを転送する。 VEGF（20 ng / ml）を、NT – 3（10 ng / mlの）、およびBDNF（10 ng / ml）を一日おきにを含むNSCのメディアを交換してください。神経突起有利子神経細胞と色素細胞の広範なネットワークは、連続培養し、時間と数の増加の2週間以内に表示されるようになります、そして3ヶ月以上持続することができます。 7。代表的な結果： レチノイン酸（RA）が独占的に多能性の神経外胚葉性の表現型（ 図2A）に移行するために定義された培養系で維持ヒトES細胞を誘導するのに十分レンダリングされます。 RAへの未分化ヒトES細胞の露光時に、コロニー内のすべてのセルは形態変化を受けることになる多能性関連マーカーを発現停止大きな分化した細胞は、などのOCT – 4で示され、様々な神経外胚葉関連などHNK1ようなマーカー、、AP2、およびTrkCを（ 図2B）を発現始まります。これらの大規模な分化細胞は、乗算していきますし、コロニーが初期神経マーカーβ- III -チューブリン（ 図2B）を発現するために自発的に進んで、サイズが大きくなります。より成熟した神経のマーカーMAP – 2は細胞が（ 図2B）積み上げてきたコロニーの地域で表示されるようになります。神経外胚葉細胞と神経分化の外観と一致する、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）遺伝子16のドーパミン作動性ニューロンの分化活性化に関与する神経細胞特異的転写因子Nurr1は、核（ 図2B）に転位するでしょう。取り外した後は、RA処理したヒトES細胞は、懸濁液のカルトに浮遊細胞のクラスターを（神経芽細胞）が形成される神経分化のプロセスを継続するものをいい、ラベルにより表示。 bFGFおよび組織培養プレートに付着または無血清定義された培地中でラミニン/コラーゲン重合3次元マトリックス中に播種する神経芽細胞を許可した後、β- III -チューブリンとMAP – 2発現、神経突起の除去時に有利子細胞と色素細胞は、同じ期間での治療なしでヒトES細胞の自発的な多系統分化に比べて効率の大幅な増加と表示されるようになります、そして3ヶ月以上（ 図2C）のために持続することができる。 図1に排他的に小分子の単純な提供により、特定の臨床的に意義のある系統のヒト多能性幹細胞のよく制御された効率的な誘導の概略図。 図2 <stroNG>レチノイン酸は、神経系統の仕様と定義された条件の下で多能性の直接の神経細胞の進行を誘導する。（A）回路図は、ヒトES細胞の指示神経分化のプロトコルのタイムラインを描く。コントロールとして、模擬処理（DMSO）ヒトES細胞に比べて（B）定義された培養システムの下でレチノイン酸（RA）への未分化ヒトES細胞の曝露時には、コロニー内の大規模差別OCT – 4（赤）陰性細胞は、現れ始めた。 RA誘導性差別OCT – 4陰性細胞が発現するHNK – 1（赤）、AP2（赤）、TrkC（緑）、および初期の神経外胚葉の分化と一貫してβ- III -チューブリン（赤）、し始めた。これらの細胞は、最終的に通常の細胞を蓄積し始めたの分野における神経マーカーMAP – 2（緑）を発現する成熟し続けた。神経外胚葉細胞と神経分化の外観と一致する、で神経細胞特異的転写因子Nurr1（緑）、関与ドーパミン作動性ニューロンの分化チロシンヒドロキシラーゼ（TH）遺伝子の活性化は、核へ移行。すべての細胞はその核のDAPI染色（青色）で表示されます。 β- III -チューブリン（赤）およびMAP – 2を（緑、3次元マトリックスに示されている）を発現する神経突起有利子細胞の広範なネットワークにより評価される（C）RAの治療は、高効率で神経細胞系に向かって分化を誘導する。矢印は、中枢神経系におけるそれらの典型的な色素細胞を示している。すべての細胞は、インセットで、その核のDAPI染色（青色）で表示されます。スケールバーは0.1ミリメートル。