Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.
C'è un grande bisogno insoddisfatto di una clinicamente adeguata fonte di cellule neuronali umane per la riparazione o rigenerazione del danneggiato sistema nervoso centrale (SNC) struttura e circuiti nel settore sanitario di oggi. Terapie basate sulle cellule sono molto promettenti per ripristinare il tessuto nervoso e la funzione perduta per i disturbi del sistema nervoso centrale. Tuttavia, terapie cellulari basate sul sistema nervoso centrale, cellule staminali neurali hanno incontrato limitazioni e difficoltà di alimentazione da utilizzare in ambito clinico grazie alla loro capacità di espansione limitata di cultura e di plasticità, dopo non aver esteso 1-3 passaging. Nonostante alcuni risultati positivi, il CNS-derivato cellule staminali neurali (hNSCs) sembrano esercitare i loro effetti terapeutici principalmente dalla loro progenie non neuronali attraverso la produzione trofica e le molecole neuroprotettive per salvare le cellule endogene 1-3. In alternativa, pluripotenti le cellule staminali embrionali umane (hESC) proffer cure per una vasta gamma di disturbi neurologici da supplying la diversità dei tipi di cellule umane neuronali del sistema nervoso centrale di sviluppo per la rigenerazione 1,4-7. Tuttavia, come incanalare il potenziale ampia differenziazione delle hESC pluripotenti in modo efficiente e prevedibile di un fenotipo desiderato è stato una grande sfida sia per lo studio e la traduzione di sviluppo clinico. Approcci convenzionali si basano su multi-lignaggio inclinazione di cellule pluripotenti attraverso la differenziazione spontanea foglietto embrionale, con conseguente inefficienza e incontrollabile lignaggio impegno che viene spesso seguita da eterogeneità fenotipica e instabilità, di conseguenza, un elevato rischio di tumorigenicità 7-10. Inoltre, non definito integratori stranieri / animale biologica e / o alimentatori che sono stati generalmente utilizzati per l'isolamento, l'espansione e la differenziazione delle hESC può utilizzarli direttamente di tali cellule specializzate innesti nei pazienti problematici 11-13. Per superare questi ostacoli, abbiamo risolto gli elementi di un sistema di coltura definito necessaria e sufficiente per sustaining il pluripotence epiblast di hESC, che funge da piattaforma per la derivazione de novo di hESC clinicamente adeguata ed efficace regia hESC quali uniformemente verso lignaggi clinicamente rilevanti da piccole molecole 14 (vedere uno schema in figura. 1). L'acido retinoico (RA) non induce la differenziazione neuronale di hESC indifferenziata mantenuta su linee 1, 14. E a differenza di CES del mouse, trattando corpi embrionali hESC differenziato (EBS) solo leggermente aumenta la bassa resa dei neuroni 1, 14, 15. Tuttavia, dopo lo screening di una serie di piccole molecole e fattori di crescita, abbiamo riscontrato che tali condizioni definite reso acido retinoico (RA) sufficiente a indurre le specifiche del neuroectoderma diretto da hESC pluripotenti che ulteriormente progredita al neuroblasti che ha generato umano progenitori neuronali ed i neuroni nel SNC di sviluppo con alta efficienza (Fig. 2). Abbiamo definito le condizioni per l'induzione della neuroesplosioni diretto da hESC pluripotenti senza un intervento a più fasi embrionali lignaggio corpo, consentendo ben controllati derivazione efficiente di una grande quantità di cellule neuronali tutta la gamma di stadi di sviluppo per le terapie basate sulle cellule.
Una delle sfide più importanti sia per lo studio dello sviluppo e la traduzione clinica è stata come incanalare le ampie potenzialità di differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti da un fenotipo desiderato in modo efficiente e prevedibile. Anche se tali cellule possono differenziarsi spontaneamente in vitro in cellule di tutti gli strati germinali passando attraverso un multi-stadio lignaggio aggregato, solo una piccola frazione di cellule perseguire un 1,4 lignaggio dato. In questi hESC derivati aggregati, la simultanea comparsa di una notevole quantità di ampiamente divergenti tipi di cellule indesiderate che possono risiedere in tre strati germinali embrionali rende spesso la comparsa di fenotipi desiderati non solo inefficiente, ma incontrollabile e inaffidabile pure. Anche se lignaggi cardiache e neuronali sono stati ottenuti in precedenti relazioni, tuttavia, l'inefficienza nella generazione di cellule specializzate attraverso strato germinale, l'induzione di cellule pluripotenti e l'alto rischio di cancerogenicità a seguito transplantation hanno impedito ulteriori traduzioni cliniche.
Le linee di hESC inizialmente sono stati ottenuti e mantenuti in co-coltura con una crescita arrestato topo fibroblasti embrionali (MEF) 4. Anche se molti di alimentazione umana, senza alimentatore, e sistemi di coltura chimicamente formulati sono stati sviluppati per hESC 11-13, gli elementi necessari e sufficienti per sostenere l'auto-rinnovamento delle cellule pluripotenti umane restano irrisolti. Queste cellule alimentatore esogeni e reagenti biologici aiutano a mantenere la crescita a lungo termine stabile di hESC indifferenziata, mentre la maschera la capacità delle cellule pluripotenti di rispondere ai segnali di sviluppo. Mantenere hESC indifferenziato in un definito biologici sistema privo di cultura che consente l'espansione fedeli e controllabili differenziazione diretta è una delle chiavi per la loro utilità e le potenzialità terapeutiche. RA non era sufficiente a indurre la differenziazione neuronale di hESC indifferenziato mantenuto sotto condiz precedentemente riportatoioni contenenti cellule alimentatore esogeni. Anche se lignaggi neurale compaiono in una fase relativamente precoce nella differenziazione hESC, trattando hESC differenziato multi-lignaggio aggregati (corpi embrionali) con artrite reumatoide solo leggermente aumentato la bassa resa dei neuroni 1, 14, 15. Per raggiungere in modo uniforme la conversione di cellule staminali umane pluripotenti da una stirpe particolare, abbiamo impiegato un sistema di coltura definito in grado di assicurare la proliferazione di hESC indifferenziato per identificare le condizioni per ben controllata induzione efficiente delle hESC pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti dalla semplice fornitura di piccole molecole (Fig. 1, fig. 2). Studi futuri rivelerà molecole controllo genetico ed epigenetico dello sviluppo umano nel sistema nervoso centrale come alternative, che possono aprire la strada a piccole molecole-mediata controllo diretto e la modulazione del destino hESC quando pluripotenti derivanti lignaggi clinicamente rilevanti per terapie rigenerative. Senza trattamento con RA, 1-5HESC% sarà oggetto di differenziazione spontanea in neuroni 1, 14, 15. Con il trattamento con RA, siamo stati in grado di generare> 95% progenitori embrionali neuronali ed i neuroni dalle hESC mantenuto nell'ambito di una definizione di cultura in un processo che potrebbe emulare sviluppo embrionale umano 14. Recentemente, noto neurali destino determinare i geni sono stati utilizzati per transdifferenziarsi fibroblasti di topo adulto in progenitori neurali e dei neuroni con un basso livello di efficienza che vanno 0,5-8% 17, 18. Tuttavia, riprogrammato le cellule somatiche sono state storicamente associato con l'espressione genica anormale e senescenza accelerata con compromissione della utilità terapeutica 19-21. Infine, il protocollo abbiamo stabilito qui è limitato alle hESC pluripotenti derivate dalla massa cellulare interna (ICM) o epiblast della blastocisti umana 4, non possono applicarsi a cellule pluripotenti altri, tra cui origine animale-CES, CES derivati da precedenti morula (otto celle) embrioni allo stadio 22, e artificially cellule riprogrammate 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP è stato sostenuto dal National Institute of Health (NIH) sovvenzioni da National Institute on Aging (NIHK01AG024496) e The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano (NIHR21HD056530).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
all-trans-Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565018 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Human BDNF | PeproTech | AF-450-02 | |
Human VEGF | PeproTech | AF-100-20 | |
Human NT-3 | PeproTech | 450-03 | |
Heparin | Sigma | H5284 | |
N-2 supplement (100X) | Invitrogen | 17502048 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |