Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

1. Lösungs-und Medien-Vorbereitung Gelatin Beschichtungslösung: 0,1% (w / v) Gelatine in ddH 2 O, autoklaviert und bei 4 ° C. Matrigel Beschichtungslösungen. Stammlösung: langsam auftauen Matrigel (10 ml) bei 4 ° C über Nacht, 10 ml eiskaltem DMEM oder DMEM/F12, gut mischen und aliquoten 1 ml / Rohr unter sterilisiert Gewebekultur Kapuze, lagern bei -20 ° C. Working-Lösung: langsam auftauen 1 ml Matrigel Aliquot bei 4 ° C für 1-2 Stunden, Transfer zum 14 ml gekühltes DMEM oder DMEM/F12 und gut mischen unter sterilisiert Gewebekultur Haube unmittelbar vor der Beschichtung. Menschliche Laminin Beschichtungslösung: Verdünnen Sie 1 ml menschlichen Laminin-Lösung (0,5 mg / ml in Tris Buffered NaCl, Lagerung bei -80 ° C, langsam auftauen bei 4 ° C für 1-2 Stunden) mit eiskaltem DMEM oder DMEM/F12 zu 12,5 ml Arbeitslösung (40 ug / ml) unter sterilisiert Gewebekultur Haube unmittelbar vor der Beschichtung. Wachstumsfaktor Stammlösungen (500-1000X): Man löst growth factor bei 10 ug/ Ml in sterilisierte Puffer (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% Glycerin, 1XPBS) und speichern als 50-100 &mgr; l / Röhrchen aliquotiert bei -80 ° C. All-trans-Retinsäure Arbeitslösung (1000X): 10 mM in DMSO, speichern in Aliquots bei -80 ° C. HESC Medien: DMEM/F12 oder KO-DMEM (80%), KO Serumersatz (20%), L-Alanyl-L-Gln oder L-Gln (2 mM), MEM nicht essentielle Aminosäuren (MNAA, 1X) und β-Mercaptoethanol (100 uM), filtriert und bei 4 ° C mit 20 ng / ml bFGF vor der Verwendung ergänzt. Oder ersetzen Sie "knock out (KO) Serum-Ersatz" mit definierten Komponenten: DMEM/F12 oder KO-DMEM (100%), L-Alanyl-L-Gln oder L-Gln (2 mM), MNAA (1X), MEM wesentliche Aminosäuren (MEAA, 1X) und β-Mercaptoethanol (100 uM), filtriert und bei 4 ° C, mit bFGF (20 ng / ml), Insulin (20 ug / ml), Ascorbinsäure (50 ug / ergänzt ml), Human Aktivin A (50 ng / ml), Humanalbumin / Albumax (10 mg / ml), und menschliches Transferrin (8 pg / ml) vor der Verwendung. NSC Medien: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1X), Heparin (8 pg / ml). 2. Plattenbeschichtung Coat-Platten mit Gelatine: 2,5 ml / well der Gelatine-Lösung bis 6-Well-Platten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator. Coat-Platten mit Laminin: chill Gelatine beschichteten Platten und entfernen Gelatine, 2,5 ml / well Matrigel oder menschliche Laminin-Beschichtung funktionierende Lösung zu vorgekühlte verkleistert 6-Well-Platten und Inkubation bei 4 ° C über Nacht. 3. Passagieren und Seeding Undifferenzierte hESCs unter definierten Bedingungen Lassen hESC Kolonien wachsen auf 5-7 Tage alt, und nehmen Sie hESC Kultur Platte Präpariermikroskop (pre-warm Sezieren der Bühne bis 37 ° C) unter Sezieren sterilisiert Kapuze. Wählen Sie hESC Kolonien aufgeteilt werden. Morphologisch sind diese Kolonien> 75% undifferenzierte hES (kleine kompakte Zellen), in der Regel leicht opake (nicht weißen aufgehäuften Zellen nicht klar differenzierten Zellen) mit definierten Rand un habenderneath dem Binokular. Vorsichtig einen Überblick über die ausgewählten Kolonien und entfernen differenzierten Fibroblasten-Schicht rund um die Kolonie und alle differenzierten Teile (falls vorhanden) der Kolonie mit der Schärfe des P2 sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. (Bitte beachten Sie, pluripotenten hES auf eine vorübergehende Phase, eine spontane Differenzierung selbst unter optimalen Bedingungen, obwohl bevorzugt, es schwierig festzustellen, Thesen Zellen sind 100% undifferenzierte unter Binokular,> 75% undifferenziert sind in der Regel als der Pass Punkt betrachtet. Die differenzierten Zellen in der Regel nicht Samen und weiter wachsen, beseitigt in der Passage-Prozess) Entfernen Sie die alten Medien mit schwimmenden freistehende differenzierten Zellen durch Absaugen. Waschen mit hESC Medien (ohne bFGF) einmal. 3 ml / well frisches hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF. Schneiden Sie die undifferenzierte hES-Kolonien in kleine Stücke, und lösen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. Pool der Medien, die losgelöst Kolonie Stücke zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte einmal mit 1 ml / well hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und Pool zusammen. Saugen Sie das Matrigel oder menschliche Laminin-Lösung von dem beschichteten frischen Platten. Aliquot 4 ml / well hESC Medien mit Kolonie Stücke zu einer 6-Well-Platte. Gently Transfer der Platte Inkubator ohne Schütteln und lassen Kolonie Stücke Samen über Nacht, ohne zu stören in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. 4. Neuronale Induktion von hESCs unter definierten Kultur-System mit Retinsäure Am Tag 3 nach der Aussaat, die Abschaffung der meisten alten Medien aus jedem Well der Platte und lassen genug Medien zu ermöglichen hESC Kolonien unter Wasser (niemals zulassen hESCs austrocknen) werden. Ersetzen mit 4 ml / well frisches hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und 10 uM Retinsäure. Ersetzen Sie die alten Medien mit frischen hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und10 uM Retinsäure jeden zweiten Tag, und lassen neural-induzierten embryonalen Stammzellen Kolonien wachsen zu Tag 7 oder 8. Alle Zellen innerhalb der Kolonie zu unterziehen Morphologie Änderungen an großen differenzierten Zellen, die auch weiterhin vermehren wird. Die Kolonien werden in der Größe zu erhöhen, um die Platte am Tag 7 oder 8 abdecken, und die Zellen beginnen, häufen sich in einigen Gebieten der Kolonien. 5. Continuing Neuronale Differenzierung in Suspensionskultur Nehmen hESC Kultur Platte Präpariermikroskop (pre-warm Sezieren der Bühne bis 37 ° C) unter Sezieren sterilisiert Kapuze. Vorsichtig einen Überblick über die Kolonien und entfernen Fibroblasten-Schicht rund um die Kolonie (differenzierte Zellen aus der Kolonie eingewandert) mit dem Rand des P2 sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. Entfernen Sie die alten Medien mit schwimmenden freistehende Fibroblasten-Zellen durch Absaugen. Waschen mit hESC Medien (ohne bFGF) einmal. 3 ml / well frisches hESC Medien (ohne bFGF). Schneiden Sie die neural-induced hESC Kolonien in kleine Stücke, und lösen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. Pool der Medien, die losgelöst Kolonie Stücke zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte einmal mit 1 ml / well hESC Medien (ohne bFGF) und Pool zusammen. Aliquot 4 ml / well serumfreiem hESC Medien mit Kolonie Stücke zu einer 6-well ultraniedrigen Befestigungsplatte und inkubieren bei 37 ° C befeuchteten Inkubator, damit schwimmende zellulären Clustern (Neuroblasten) für 4-5 Tage zu bilden. 6. Neuronalen Phänotyp Reifung in Adhesive Kultur Pool der Medien mit schwimmenden Neuroblasten zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifugation bei 1400 rpm für 5 min. Saugen Sie die alten Medien so viel wie du kannst, und fügen Sie die gleiche Menge frischen NSC Medien mit VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) und BDNF (10 ng / ml). Pipette auf und ab zu schweben Neuroblasten und aliquoten 4 ml / well bis 6-Well-Platten mischen. Die Neuroblasten können auch an sich seineded in einem Laminin / Kollagen (Matrigel) oder menschliche Laminin polymerisiert 3-dimensionale Matrix in serum-freien NSC Medien mit VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) und BDNF (10 ng / ml) . Übertragen Sie die Platten auf eine 37 ° C befeuchteten Inkubator, damit Neuroblasten zu befestigen Nacht. Ersetzen NSC Medien mit VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) und BDNF (10 ng / ml) jeden zweiten Tag. Umfangreiche Netzwerke von Neuriten tragenden neuronalen Zellen und pigmentierten Zellen beginnen, innerhalb von 2 Wochen kontinuierlichen Kultivierung und Erhöhung der Zahl mit der Zeit auftreten, und könnten für über 3 Monate aufrechterhalten werden. 7. Repräsentative Ergebnisse: Retinsäure (RA) dargestellt wird ausreichen, um hESCs in den definierten Kultur-System zum Übergang erhalten von Pluripotenz ausschließlich auf eine neuroektodermalen Phänotyp (Abb. 2A) zu induzieren. Bei der Belichtung von undifferenzierten hES zu RA werden alle Zellen innerhalb des Koloniemorphologie Veränderungen zu unterziehengroßen differenzierten Zellen, die zum Ausdruck Pluripotenz-assoziierter Marker nicht mehr, wie durch Oct-4, und beginnen Ausdruck verschiedener Neuroektoderms-assoziierte Marker wie HNK1, AP2, und TrkC (Abb. 2B). Diese großen differenzierten Zellen wird auch weiterhin zu vermehren und die Kolonien an Größe zunehmen, ausgehend spontan auf den frühen neuronalen Marker β-III-Tubulin (Abb. 2B) auszudrücken. Die reiferen neuronalen Marker MAP-2 beginnen, in den Gebieten der Kolonien, in denen Zellen auf (Abb. 2B) angehäuft haben scheinen. Gleichzeitig mit dem Erscheinen der neuroektodermalen Zellen und neuronalen Differenzierung wird die neuronale spezifische Transkriptionsfaktor Nurr1, in dopaminergen neuronalen Differenzierung und Aktivierung der Tyrosin-Hydroxylase (TH) Gen 16 verwickelt, in den Zellkern (Abb. 2B) zu verlagern. Nach losgelöst, wird der RA-Behandlung hESCs schwimmenden zellulären Clustern (Neuroblasten) in einer Suspension Kult Formure auf die neuronale Differenzierung fortzusetzen. Nach dem Entfernen von bFGF und nach erlaubt die Neuroblasten zu einer Gewebekultur Platte oder in einem Laminin / Kollagen polymerisiert 3-dimensionale Matrix in einem serumfreien Medium definiert, β-III-Tubulin-und Map-2-Expression, Neuriten ausgesät legen -tragenden Zellen und pigmentierten Zellen werden beginnen, mit einer drastischen Steigerung der Effizienz als die spontane multi-lineage Differenzierung von hES ohne Behandlung über den gleichen Zeitraum im Vergleich erscheinen und könnte für mehr als 3 Monate (Abb. 2C) aufrechterhalten werden. Abbildung 1 Eine schematische Darstellung gut kontrollierten effiziente Induktion von menschlichen pluripotenten Stammzellen ausschließlich zu einem bestimmten klinisch relevanten Linie durch eine einfache Bereitstellung von kleinen Molekülen. Abbildung 2 <strong> Retinsäure induziert neuronale Linie Spezifikation und neuronale Progression direkt von Pluripotenz unter definierten Bedingungen. (A) Schematische Darstellung des Protokolls Zeit Linie gerichtet neuronalen Differenzierung von hES. (B) Bei der Belichtung von undifferenzierten hES zu Retinsäure (RA) unter den definierten Kultur, großer differenzierte Oct-4 (rot)-negativen Zellen innerhalb der Kolonie begann zu entstehen, im Vergleich zu mock-behandelt (DMSO) hESCs als Kontrolle . RA-induzierte differenzierte Oct-4-negativen Zellen begannen sich zu äußern HNK-1 (rot), AP2 (rot), TrkC (grün), und dann β-III-Tubulin (rot), im Einklang mit frühen neuroektodermalen Differenzierung. Diese Zellen weiter zu reifen letztlich Ausdruck der neuronalen Marker Map-2 (grün), in der Regel in Bereichen, in denen Zellen begannen sich zu häufen. Gleichzeitig mit dem Erscheinen der neuroektodermalen Zellen und neuronalen Differenzierung, die neuronale spezifische Transkriptionsfaktor Nurr1 (grün), in Verbindung gebrachtdopaminergen neuronalen Differenzierung und Aktivierung der Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Gen, in den Zellkern transloziert. Alle Zellen sind durch DAPI-Färbung ihrer Kerne (blau dargestellt). (C) RA-Behandlung induziert die Differenzierung in Richtung eines neuronalen Linie mit hoher Effizienz durch umfangreiche Netzwerke von Neuriten-tragenden Zellen, die β-III-Tubulin (rot) und Map-2 (grün, in einem 3-dimensionale Matrix dargestellt) beurteilt. Die Pfeile zeigen die pigmentierten Zellen typisch für jene im ZNS. Alle Zellen sind durch DAPI-Färbung ihrer Kerne (blau) in den Einsätzen gezeigt. Maßstabsbalken: 0,1 mm.