Nous avons établi un protocole pour l'induction de neuroblastes direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d'une offre importante de progéniteurs neuronaux humains et neuronale types de cellules dans le développement du SNC pour les neurones de réparation.
Il ya un grand besoin non satisfait d'une source cliniquement approprié de cellules neuronales humaines pour la réparation ou la régénération du système nerveux endommagé central (SNC) la structure et les circuits dans l'industrie des soins de santé d'aujourd'hui. Des thérapies cellulaires sont très prometteurs pour restaurer le tissu nerveux et la fonction perdue pour les troubles du SNC. Toutefois, les thérapies cellulaires basés sur le SNC dérivées des cellules souches neurales ont rencontré restriction de l'offre et de la difficulté à utiliser dans le cadre clinique en raison de leur capacité d'expansion limitée dans la culture et de la plasticité ne après de longues 1-3 repiquage. Malgré quelques effets bénéfiques, le CNS dérivées des cellules souches neurales (hNSCs) semblent exercer leurs effets thérapeutiques principalement par leur non-neuronales descendances grâce à la production et trophiques molécules neuroprotectrices pour sauver les cellules endogènes 1-3. Alternativement, pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) cures proférer pour une large gamme de troubles neurologiques par supplying la diversité des types de cellules neuronales humaines dans le SNC en développement pour la régénération 1,4-7. Cependant, comment canaliser le potentiel de différenciation des CSEh gamme pluripotentes efficacement et de façon prévisible à un phénotype désiré a été un défi majeur pour les deux étude sur le développement et la traduction clinique. Les approches classiques s'appuient sur la multi-lignée de cellules pluripotentes inclinaison grâce à la différenciation de germe de la couche spontanée, résultant dans la lignée de l'engagement-inefficace et incontrôlable qui est souvent suivie d'hétérogénéité phénotypique et de l'instabilité, par conséquent, un risque élevé de tumorigénicité 7-10. En outre, les étrangers non définie / animal suppléments biologiques et / ou des mangeoires qui ont généralement été utilisé pour l'isolation, l'expansion et la différenciation des CSEh peuvent faire usage direct de ces cellules spécialisées greffes chez des patients problématiques 11-13. Pour surmonter ces obstacles, nous avons résolu les éléments d'un système de culture définies nécessaire et suffisante pour sustaining l'épiblaste pluripotence des CSEh, servant de plateforme de novo dérivation de CSEh cliniquement appropriée et efficace de diriger les CSEh uniforme de telles lignées envers cliniquement pertinente par de petites molécules 14 (s'il vous plaît voir un schéma de la figure 1.). L'acide rétinoïque (AR) n'induit pas de différenciation neuronale des CSEh indifférenciées maintenu sur les départs 1, 14. Et contrairement CES souris, le traitement des CSEh différenciées corps embryoïdes (EB) n'augmente que faiblement le faible rendement des neurones 1, 14, 15. Cependant, après criblage d'une variété de petites molécules et des facteurs de croissance, nous avons constaté que ces conditions définies rendu l'acide rétinoïque (AR) suffisante pour induire la spécification de neuroectoderme direct de CSEh pluripotentes encore progressé au neuroblastes qui a généré humaine progéniteurs neuronaux et les neurones dans le SNC en développement avec une grande efficacité (Fig. 2). Nous avons défini les conditions d'induction de la neuroexplosions direct de CSEh pluripotentes sans intervention multi-lignée stade de corps embryoïdes, permettant bien contrôlée de dérivation efficace d'une grande quantité de cellules neuronales humaines à travers le spectre des stades de développement à base de cellules thérapeutiques.
Un des défis majeurs pour les deux étude sur le développement et la traduction clinique a été la manière de canaliser le potentiel de différenciation éventail de cellules souches humaines pluripotentes à un phénotype désiré de manière efficace et prévisible. Bien que ces cellules peuvent se différencier spontanément in vitro en cellules de toutes les couches de germe en passant par une phase globale multi-lignée, seule une petite fraction des cellules poursuivre une lignée de 1,4 donnée. Dans ces agrégats CSEh dérivées, l'apparition simultanée d'une quantité importante de types de cellules largement divergentes indésirables qui peuvent résider dans les trois feuillets embryonnaires fait souvent l'émergence de phénotypes souhaités non seulement inefficace, mais incontrôlables et peu fiables aussi bien. Bien que les lignées cardiaques et neuronaux ont été tirés dans les rapports précédents, cependant, l'inefficacité dans la production des cellules spécialisées par le biais de germe de couche-induction de cellules pluripotentes et le risque élevé de tumorigénicité suivantes transplantation ont entravé autre traduction clinique.
Les lignées de CSEh ont été dérivées d'abord et maintenus en co-culture avec la croissance des fibroblastes embryonnaires de souris arrêtés (FAE) 4. Bien que plusieurs d'alimentation humaine, alimentation-libres et des systèmes de culture chimiquement formulés ont été développés pour les CSEh 11-13, les éléments nécessaires et suffisants pour soutenir l'auto-renouvellement des cellules pluripotentes humaines restent non résolus. Ces cellules nourricières exogènes et réactifs biologiques aident à maintenir la croissance stable à long terme des CSEh indifférenciées alors le masque de la capacité des cellules pluripotentes à réagir aux signaux du développement. Maintenir CSEh indifférenciées dans un système de culture biologiques sans définie qui permet l'expansion fidèle et contrôlables différentiation directe est l'une des clés de leur utilité thérapeutique et potentiels. RA n'a pas été suffisante pour induire la différenciation neuronale des CSEh indifférenciées maintenu sous condit précédemment rapportéions contenant des cellules nourricières exogènes. Bien que les lignées neurales apparaître à un stade relativement précoce de la différenciation des CSEh, traitant de CSEh différenciées multi-lignée agrégats (corps embryoïdes) atteints de PR que légèrement augmenté le faible rendement des neurones 1, 14, 15. Afin d'atteindre uniformément conversion des cellules souches pluripotentes humaines d'une lignée particulière, nous avons employé un système de culture définies capable d'assurer la prolifération des CSEh indifférenciées d'identifier les conditions pour bien contrôlée par induction efficace de CSEh pluripotentes exclusivement à une lignée particulière cliniquement pertinentes par simple mise à disposition de petites molécules (Fig. 1, Fig. 2). Des études futures révèlent molécules contrôle génétique et épigénétique dans le développement du système nerveux central humain comme des alternatives, qui peuvent ouvrir la voie à de petites molécules à médiation contrôle direct et la modulation du destin pluripotentes CSEh lors de la dérivation des lignées cliniquement pertinentes pour les thérapies régénératrices. Sans traitement RA, 1-5CSEh% va subir une différenciation spontanée en neurones 1, 14, 15. Avec traitement de la PR, nous avons été en mesure de générer> 95% d'embryons progéniteurs neuronaux et les neurones à partir de CSEh maintenu sous une culture de définir dans un processus qui pourrait émuler le développement embryonnaire humain 14. Récemment, connue neural sort déterminant les gènes ont été utilisés pour transdifférencier fibroblastes de souris adultes en progéniteurs neuronaux et les neurones avec une faible efficacité allant de 0,5 à 8% 17, 18. Toutefois, reprogrammées cellules somatiques ont été historiquement associée à l'expression des gènes anormaux et de la sénescence accélérée avec une utilité thérapeutique déficience 19-21. Enfin, le protocole, nous avons établi ici est limitée à CSEh pluripotentes dérivées de la masse cellulaire interne (MCI) ou épiblaste de l'humain blastocyste 4, ne s'appliquent pas à d'autres cellules pluripotentes, y compris les animaux provenaient des CES, les CES issus de précédentes morula (huit cellules) au stade embryons 22 et artifcellules reprogrammées icially 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP a été soutenue par le National Institute of Health (NIH) des subventions de l'Institut national sur le vieillissement (NIHK01AG024496) et The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health et le développement humain (NIHR21HD056530).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
all-trans-Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565018 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Human BDNF | PeproTech | AF-450-02 | |
Human VEGF | PeproTech | AF-100-20 | |
Human NT-3 | PeproTech | 450-03 | |
Heparin | Sigma | H5284 | |
N-2 supplement (100X) | Invitrogen | 17502048 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |