أقمنا على بروتوكول لتحريض مباشر من neuroblasts المحفزة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في ظل ظروف محددة المحافظة مع الجزيئات الصغيرة ، والتي تمكن من اشتقاق كميات كبيرة من الخلايا العصبية أسلاف الإنسان وأنواع الخلايا العصبية الخلية في الجهاز العصبي المركزي النامية لإصلاح العصبية.
There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today’s healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.
كان واحدا من التحديات الكبرى على حد سواء دراسة تنموية والترجمة السريرية كيفية توجيه إمكانات واسعة من تمايز الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان إلى النمط الظاهري المطلوب بكفاءة ويمكن التنبؤ به. على الرغم من أن مثل هذه الخلايا يمكن التفريق بصورة عفوية إلى خلايا في المختبر من كل الطبقات الجرثومية التي تمر في مرحلة تجميع متعددة النسب ، سوى جزء صغير من الخلايا اتباع 1،4 نسب معينة. في تلك المجاميع hESC المشتقة ، وظهور المتزامن لكمية كبيرة من اختلاف أنواع الخلايا غير المرغوب فيها على نطاق واسع قد تكون موجودة في ثلاث طبقات جرثومية جنينية غالبا ما يجعل ظهور الظواهر المطلوب ليس فقط غير فعالة ، ولكن لا يمكن السيطرة عليها ولا يمكن الاعتماد عليها كذلك. على الرغم من أن استمدت الأنساب القلب والعصبية في التقارير السابقة ، ومع ذلك ، فإن عدم الكفاءة في توليد الخلايا المتخصصة من خلال تحريض الجرثومية طبقة من الخلايا المحفزة ومخاطر عالية من tumorigenicity التالية transplantatioن الترجمة أعاقت المزيد من السريرية.
خطوط hESC في البداية كانت تستمد والمحافظة عليها في الثقافة بالتعاون مع نمو الخلايا الليفية القبض على الفأر الجنينية (MEFs) 4. وإن كانت قد وضعت عدة تغذية الإنسان ، التغذية الحرة ، ونظم الثقافة كيميائيا وضعت لhESCs 11-13 ، تبقى دون حل العناصر الضرورية والكافية للحفاظ على الذات تجديد الخلايا المحفزة الإنسان. هذه الخلايا المغذية الخارجية والكواشف البيولوجية مساعدة في الحفاظ على نمو مستقر على المدى الطويل من hESCs غير متمايزة في حين تحجب قدرة الخلايا المحفزة على الاستجابة لإشارات التنموية. الحفاظ على hESCs غير متمايزة في نظام محدد الثقافة البيولوجية الخالية من المؤمنين بأن يسمح التوسع والسيطرة المباشرة التمايز هو واحد من مفاتيح لفائدتها العلاجية والمحتملين. وكان RA يست كافية للحث على تمايز الخلايا العصبية من hESCs غير متمايزة في إطار الحفاظ على كونديت ذكرت سابقاالأيونات التي تحتوي على الخلايا المغذية الخارجية. على الرغم من الأنساب العصبية تظهر في مرحلة مبكرة نسبيا في التفريق hESC ، وعلاج hESC عن اختلاف نسب مجاميع متعددة (الهيئات مضغي الشكل) مع RA قليلا فقط زيادة العائد المنخفض من الخلايا العصبية 1 ، 14 ، 15. استخدمنا من أجل تحقيق تحويل موحد للخلايا الجذعية المحفزة لنسب معينة ، وهو نظام قادر على تعريف الثقافة تأمين انتشار hESCs غير متمايزة لتحديد الظروف التي تسيطر عليها بشكل جيد للتحريض كفاءة hESCs المحفزة حصرا على وجه الخصوص النسب ذات الصلة سريريا عن طريق توفير بسيط من الجزيئات الصغيرة (الشكل 1 ، الشكل 2). وسوف تكشف الدراسات المستقبلية مراقبة الجزيئات الجينية وجينية في مجال التنمية البشرية CNS كبدائل ، والتي قد تمهد الطريق للسيطرة على جزيء صغير بوساطة مباشرة والتشكيل مصير المحفزة hESC عند اشتقاق الأنساب سريريا ذات الصلة لعلاجات التجدد. من دون علاج التهاب المفاصل الروماتويدي ، 1-5وسوف يخضع hESCs ٪ التمايز عفوية إلى خلايا عصبية 1 ، 14 ، 15. مع علاج التهاب المفاصل الروماتويدي ، كنا قادرين على توليد> 95 ٪ أسلاف الخلايا العصبية الجنينية والخلايا العصبية من hESCs حافظت ظل ثقافة تحدد في العملية التي قد تحاكي التطور الجنيني البشري 14. في الآونة الأخيرة ، استخدمت يعرف مصير العصبية تحديد الجينات إلى الخلايا الليفية transdifferentiate الماوس إلى الأسلاف الكبار العصبية والخلايا العصبية مع انخفاض كفاءة تتراوح بين 0،5-8 ٪ 17 و 18. ومع ذلك ، فقد تم إعادة برمجة الخلايا تاريخيا الجسدية المرتبطة الشاذ التعبير الجيني وتسارع الشيخوخة مع فائدة علاجية ضعاف 19-21. أخيرا قد يقتصر البروتوكول أسسنا هنا لhESCs المحفزة المستمدة من الكتلة الخلوية الداخلية (ICM) أو الأديم الظاهر من الكيسة الإنسان 4 ، لا ينطبق على الخلايا المحفزة الأخرى ، بما فيها المجالس الاقتصادية والاجتماعية ، نشأت المجالس الاقتصادية والاجتماعية الحيوانية المستمدة من morula في وقت سابق (ثمانية خلية) في مرحلة الأجنة 22 ، وartifإعادة برمجة الخلايا icially 23.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم XHP بواسطة المعهد الوطني للمنح (NIH) الصحة من المعهد الوطني للشيخوخة (NIHK01AG024496) يونيس كينيدي وشرايفر المعهد القومي لصحة الطفل والتنمية البشرية (NIHR21HD056530).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
all-trans-Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565018 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Human BDNF | PeproTech | AF-450-02 | |
Human VEGF | PeproTech | AF-100-20 | |
Human NT-3 | PeproTech | 450-03 | |
Heparin | Sigma | H5284 | |
N-2 supplement (100X) | Invitrogen | 17502048 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |