Une méthode pour l'étiquetage dans les vaisseaux sanguins souris embryonnaires
Summary
Cet article décrit une méthode pour l'étiquetage de peau embryonnaire et les vaisseaux sanguins du thymus.
Abstract
La mise en place d'un réseau de vaisseaux sanguins fonctionnelle est une partie essentielle de l'organogenèse, et est requis pour la fonction des organes optimale. Par exemple, dans la formation adéquate vascularisation du thymus et de structuration est indispensable pour l'entrée dans l'organe thymocytes matures et les cellules T de sortie vers la périphérie. La disposition spatiale des vaisseaux sanguins dans le thymus est dépendante des signaux du micro-environnement local, à savoir les cellules épithéliales thymiques (TEC). Plusieurs rapports récents suggèrent que la perturbation de ces résultats signaux dans la cuve 1,2 thymus défauts sang. Des études précédentes ont décrit les techniques utilisées pour étiqueter les 1,2 vascularisation néonatale et adulte du thymus. Nous démontrons ici une technique de marquage des vaisseaux sanguins dans le thymus embryonnaire. Cette méthode combine l'utilisation de FITC-dextran ou Griffonia (Bandeiraea) lectine Simplicifolia I (GSL 1 – isolectine B 4) injections veine faciale et CD31 coloration des anticorps pour identifier les structures vasculaires du thymus et PDGFR-β à l'étiquette du thymus périvasculaire mésenchyme 3-5. L'option d'utiliser cryocoupes ou sections vibratome est également fourni. Ce protocole peut être utilisé pour identifier les défauts du thymus vasculaire, ce qui est essentiel pour définir les rôles des molécules dérivées de TCE dans la formation des vaisseaux sanguins du thymus. Comme la méthode des étiquettes de la vascularisation entier, il peut aussi être utilisée pour analyser les réseaux vasculaires dans de multiples organes et de tissus dans l'embryon, y compris la peau et le cœur 6-10.
Protocol
Discussion
Whole-monter et PECAM-1 (CD31) sur la coloration des sections sont les méthodes classiques pour l'étiquetage de la vascularisation de souris embryonnaires. Ces méthodes nécessitent l'utilisation d'immunofluorescence directe et / ou indirects, et des détergents pour perméabiliser les tissus de la souris. Cela s'avère un processus plutôt rapide. Ici, nous avons employé FITC-dextran ou isolectine B 4 injections veine faciale pour marquer directement la vascularisation embryonnaire, élim…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par numéros de subvention et de R01AI055001 R01AI082127 du NIAID à la GRN et le Prix SREB bourse de thèse à JLB.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| FITC-dextran | Sigma | FD150S-1G |
| Fluorescein labeled GSL 1 – isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 |
| PFA | Fluka | 76240 |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR | 25608-930 |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 |
| rat anti-mouse CD31, | BD Pharmingen | 558736 |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 |
| Benzyl Alcohol | Acros Scientific | 148390010 |
| Benzyl Benzoate | Acros Scientific | 105860010 |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Scientific | 152222 |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F |
| Superfrost/Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| 4mL clear vials | National Scientific | B7800-2 |
Referências
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