L'uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno
Summary
Questo metodo permette la caratterizzazione di batteri estesa co-coltura con EpiAirways, primario dei tessuti epiteliali respiratorie umane cresciute all'interfaccia aria-liquido, un biologicamente rilevanti<em> In vitro</em> Modello. L'approccio può essere utilizzato con qualsiasi microbo che è suscettibile di lungo termine co-coltura.
Abstract
Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) sono umani adattati batteri Gram-negativi che possono causare infezioni ricorrenti e croniche della mucosa respiratoria 1, 2. Per studiare i meccanismi con cui questi organismi sopravvivono e nei tessuti delle vie respiratorie, un modello in cui il successo a lungo termine co-coltura di batteri e cellule umane possono essere eseguite è necessario. Noi uso primario tessuti umani epiteliali delle vie respiratorie sollevato in aria-liquido, il modello EpiAirway (MatTek, Ashland, MA). Questi non sono immortalati, ben differenziato, 3-dimensionale dei tessuti che contengono le giunzioni strette, le cellule ciliate e nonciliated, cellule caliciformi che producono mucina, e conservare la capacità di produrre citochine in risposta alle infezioni.
Questo biologicamente rilevanti modello in vitro delle vie aeree superiori umana può essere utilizzato in diversi modi; l'obiettivo generale di questo metodo è quello di eseguire a lungo termine co-coltura di tessuti EpiAirway con NTHi e quantificare associato alle cellule dei batteri e interiorizzato nel tempo . Inoltre, la produzione mucina e il profilo delle citochine degli infetti co-culture può essere determinato. Questo approccio migliora metodi esistenti in molti protocolli attuali che utilizzano sommersi colture monostrato o Transwell di cellule umane, che non sono in grado di supportare le infezioni batteriche per lunghi periodi 3. Per esempio, se un organismo in grado di replicare sui media sovrastante, questo può portare a livelli inaccettabili di citotossicità e la perdita di cellule ospiti, arrestando l'esperimento. Il modello EpiAirway permette la caratterizzazione di lungo termine, interazioni ospite-patogeno. Inoltre, dato che l'origine per il EpiAirway è normale umano tracheo-bronchiali cellule piuttosto che una linea immortalato, ognuno è un'eccellente rappresentazione del reale tessuto umano del tratto respiratorio superiore, sia nella struttura e nella funzione 4.
Per questo metodo, i tessuti EpiAirway sono svezzati fuori di composti anti-microbico e anti-fungini per 2 giorni prima della consegna, e tutte le procedure vengono eseguite sotto antibiotico senza condizioni. Ciò richiede considerazioni particolari, in quanto sia i batteri e primario dei tessuti umani sono usati nello stesso armadio biosicurezza, e sono co-coltura per lunghi periodi.
Protocol
Discussion
Questo metodo permette l'indagine di lungo termine, interazioni ospite-patogeno in un ambiente biologicamente rilevanti di primaria tessuti umani respiratorio all'interfaccia aria-liquido interfaccia. Qui abbiamo usato NTHi come l'organismo infettante, ma l'interazione di qualsiasi batterio che non introduce citotossicità inaccettabile nel corso del tempo può essere quantificata con questo metodo. Il modello EpiAirway può essere utilizzato anche per lo studio dei virus, le droghe, o sostanze chimiche …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Patrick Hayden (MatTek) per le discussioni utili, e Robert Smith e Libby Perry della Georgia Health Sciences University per le loro abilità EM. Questo studio è stato finanziato dalla dell'NIDCD concedere DC010187 a DAD
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue# | Comments |
|---|---|---|---|
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
Referências
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