使用的EpiAirway模型，用于描述长期宿主 - 病原体相互作用
Summary
此方法允许EpiAirways，初级人类呼吸道上皮组织生长在气 – 液界面，生物有关延长细菌共同培养的表征<em>在体外</em>车型。该方法可用于任何微生物，是经得起长期的合作文化。
Abstract
Nontypeable 流感嗜血杆菌 （NTHI）是人类适应革兰氏阴性菌，可引起复发和慢性感染的呼吸道粘膜1 2。要研究的机制，这些生物生存和呼吸组织内，一个是必需的，可以进行长期成功的细菌和人类细胞的共培养模式。我们使用初级人类呼吸道上皮组织，提高气 – 液界面，EpiAirway模型（MatTek，阿什兰，马萨诸塞州）。这些都是非永生化，分化良好，3维的组织，包含紧密连接，纤毛和nonciliated细胞，杯状细胞产生的粘蛋白，并保留产生细胞因子对感染的反应能力。
有关这种生物在人类上呼吸道的体外模型可以用在许多方面;这种方法的总体目标是，随着时间的推移执行长期NTHI和定量EpiAirway组织共培养细胞相关的和内在的细菌。同时，受感染的共同文化的生产和粘蛋白，细胞因子的个人资料才能确定。这种方法提高了，许多当前的协议后，现有的方法，利用人体细胞淹没单层或Transwell小文化，这是不能够支持长时间的细菌感染超过3。例如，如果一个有机体，可以在覆媒体复制，这可能导致在宿主细胞的细胞毒性和损失不可接受的水平，逮捕了实验。 EpiAirway模型允许长期宿主 – 病原体相互作用的特性。此外，由于EpiAirway源是人体正常细胞，而不是一个永生行气管支气管，每一个实际人类上呼吸道组织的优秀代表，在结构和功能4 ，。
对于这种方法，EpiAirway组织断奶2天交货前的抗微生物和抗真菌化合物，和所有的程序都无抗生素的条件下进行。这就需要特殊的考虑，因为这两种细菌和小学的人体组织在同一生物安全柜使用，并长时间共同培养。
Protocol
Discussion
这种方法允许的长期宿主 – 病原体相互作用的首要人权组织在气 – 液界面的呼吸生物学相关背景调查。在这里，我们使用了感染的有机体NTHI，但用这种方法可以量化的任何细菌的相互作用，不引入不可接受的细胞毒作用随着时间的推移。 EpiAirway模式也可以被用于研究病毒，药物或化学物质，影响人类的上呼吸道5 6 7 8。我们一直保持着超过40天，与NTHI感染的组织至少10天未感染的组织。我…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们想感谢帕特里克海登（MatTek），有益的讨论和利比的佐治亚州健康科学大学为他们的EM技能的罗伯特史密斯和佩里。这项研究是由NIDCD授予DC010187到DAD
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue# | Comments |
|---|---|---|---|
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
Referências
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
- Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
- Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
- Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
- Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
- Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
- Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
- Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).
