Implantation av Radiotelemetry sändare Flytning Uppgifter om EKG, hjärtfrekvens, kroppstemperaturen och aktivitet i rörliga laboratoriemöss

I djurförsök har godkänts av kantonala veterinärfrågor (Zürich, Schweiz). Bostäder och experimentella förfaranden i enlighet med schweizisk djurskyddslag och överensstämmer med det europeiska direktivet om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (DIREKTIV 2010/63/EU EUROPAPARLAMENTETS OCH RÅDETS av den 22 september 2010). 1. Preoperativ överväganden 1,1 Möss: krav på bostäder, allmänna skick och hälsoövervakning Det rekommenderas att möss levereras från leverantörer eller överförs från externa gnagare kolonier bör komma till huset anläggningen minst två veckor före operation. Denna period bör tillåta djuren att anpassa sig till den nya miljön och anläggning specifika förhållanden bostäder. Möss, som social levande djur, bör inhysas i kompatibla grupper under denna anpassningsperiod. För övervakning av en individs nivå avmat och vatten förbrukning, varje mus inrymt individuellt från 3 dagar innan operationen förrän 10 dagar efter kirurgisk sändare implantation. Den tidsplan för upprättande av telemetrisk-sändare-bärande möss visas i figur 1. Det är viktigt att djuren kommer till kirurgi vid god hälsa och kondition. Därför före operationen, bör djuren övervakas en gång per dag i 2-3 dagar om allmänna villkor (utseende, kroppshållning, spontana beteende) samt för kroppsvikt, mat och vattenförbrukning. Dessa data dokumenteras på ett journalsystem (allmänna kondition och hälsa dataövervakning blad, tabell 1) för att upprätta individuella basnivåer av allmänna förutsättningar och allmänna hälsa och välbefinnande. Alla djur som uppvisar symtom på sjukdom eller nedsatt allmäntillstånd före operationen bör uteslutas från försöket. 1,2 Hår klippning på en dag före operation Dagen före implantation, för att raka AnimALS för kirurgi, möss är bedövas kortfattat i en liten (8x8x8cm) Perspex kammare med hjälp av sevofluran (8%) eller isofluran (5%) i ren syrgas (600 ml / min). Efter förlust av rätande reflex, är musen tas ur kammaren och den främre halsen och buken hår klipps med djuret som låg i rygg VILA, anestesi bibehålls i ungefär 5 minuter med en näsa mask med sevofluran 3-4% eller isofluran 1,5-3% i rent syre med en flödeshastighet på 600 ml / min. Efter att klippa håret, djuren får vakna och sedan återförs till sina hem bur. 2. Implantation 2,1 Omvärld, förberedelse av telemetriska sändaren På dagen för implantation, alla förfaranden för sändare förberedelse och operation som utförs på en arbetsbänk med ett laminärt flöde huva försedd med en kirurgisk mikroskop. Aseptiska förhållanden garanteras genom användning av autoklaveras Instrummedelsingredienser och steriliseras material och genom att desinficera arbetsbänk 7. Före implantationen, är telemetriska sändare (ETA-F10, Data Sciences International, St Paul, MN, USA) först förberedd. Efter att från sina sterila förpackningen, är de leder till sändaren kortas till en längd lämplig för storleken på musen att implanteras. I de flesta vuxna utavlat eller inavlade möss, kan den röda elektroden förkortas till ca 42 mm och vit / färglös elektrod till en längd av ca 55 mm. Isolering slangar tas bort från den distala (sensoriska) del av leder: ca 20 mm slangar tas bort från den röda elektroden är cirka 10 mm slang bort från vit / färglös elektrod. Distala delen av varje elektrod (som nu är utan slang) formas till en loop genom att fastställa slutet med tunna siden suturer (Perma-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Tyskland). Efter beredning av elektroderna är sändaren placeras i warm steril koksaltlösning färdiga att implanteras när djuret bedövas och kirurgiskt förberedd. 2,2 Anesthesia På 5-10 minuter före induktion av inhalationsanestesi, en blandning av midazolam (4 mg / kg) och fentanyl (0,04 mg / kg) ges subkutant som premedicinering, vilket ger sedering och förebyggande smärtlindring. Allmänt inhalationsanestesi framkallas genom att placera djuret i induktionskammare och införa de flyktiga anestesimedel (sevofluran 8% eller isofluran 5% i ren syrgas 600 ml / min). När djuret visar förlust av den rätande reflex är det överförs till arbetsbänk under laminärt flöde huva och placeras i dorsala VILA på en speciellt utformad metallplåt försedd med en näsa mask och slangar från anestesi apparaten. Anestesi underhålls av spontanandning (sevofluran 3-4% eller isofluran 1,5-3% i rent syre med en flödeshastighet på 600 ml / min). Under narkos, djurets ögas är skyddade med salva (vitamin A, Bausch & Lomb, Steinhausen, Schweiz). Liggande på metallplattan djuret värms av vattenbadet uppvärmd yta (39 ° C + / -1) av arbetsbänk. 2,3 Kirurgi Huden på främre halsen och buken är desinficeras med 70% etanol. A 1 – till 1,5 cm långa snitt i huden är gjord från den nedre bröstkorgen längs mittlinjen till buken. Den negativa (vit / färglös) bly tunnlas subkutant från bröstkorgen till halsen, där ett litet snitt (≤ 0,5 cm) görs i längdriktningen. Huden och underliggande vävnader är beredda att göra plats för fixering av kabeln slinga av elektroden. Tråden slingan är fast mellan musklerna finns till höger av luftstrupe, med två tunna siden suturer (Perma-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Tyskland). Såret i halsen stängs sedan med absorberbara suturer (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Tyskland) i lager. Bukväggen är då öppnades i linea alba och kroppen av telemetriska Sändaren placeras i bukhålan av musen. Tråden slinga av den positiva (röda) elektroden sys till xiphoid processen med silke suturer på ett sådant sätt att det ligger mellan levern och mellangärdet i övre vänstra delen av buken (Figur 2). Sedan är muskeln lagren av bukhålan stängd med absorberbara suturer (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Tyskland). Innan de slutligen stänger bukväggen, en blandning av Sulfadoxin och trimetoprim [(30 mg / kg och 6 mg / kg, upplöst i 1 ml koksaltlösning (0,9%) och cirka kroppstemperatur (38-39 ° C)] sprutas in i bukhålan för tillämpningen av anti-infektiösa profylax och stödja vätska homeostas. Slutligen är huden på magen återställas med klammer (Exakt, 3 M Health Care, St Paul, MN, USA). 3. Postoperativ vård Efter avslutad kirurgi och anestesi, 0,1 mg / kg av buprenorfin (Temgesic, Essex Chemie AG, Luzern, Schweiz) och 5 mg / kg av meloxikam (Metacam, Boehringer Ingelheim, Basel, Schweiz) ges subkutant för behandling av smärta, och djuren är kvar på den varma (39 ° C + / -1) ytan av arbetsbänk att återhämta sig i ca 2h. Tillsammans med smärtlindring (två gånger dagligen: buprenorfin 0,1 mg / kg och meloxikam 5 mg / kg), är understödjande behandling som består av 300 mikroliter glukos (5%) och 300 mikroliter saltlösning (0,9%) värmas upp till kroppstemperatur, tillämpad subkutant två gånger dagligen i 4 dagar. För ytterligare återhämtning stöd, är det värt att ge djuren med en extra vattenflaska som innehåller 15% glukoslösning. Under återhämtningsperioden på 4-10 dagar, rekommenderas att djuren hålls varma. Därför, i vårt fall, är de möss inrymt i ett värmande skåp (30 ° C + / – 1). Övervakning av allmänna tillstånd och kroppsvikt, somsamt livsmedels-och vattenförbrukning, utförs en gång dagligen beroende på allmäntillstånd och hälsoövervakning datablad (tabell 1) i 10 dagar postoperativt. Humane endpoints, dvs att offra ett djur för att undvika onödigt lidande och smärta om utveckling av en inkassering är otillfredsställande, realiseras under följande villkor: Om i dåligt allmäntillstånd, dvs djuret är betydligt apatisk (ingen rörelse efter att beröring / knuffade) och dess kroppsytan känns kall trots uppvärmningen, bör djuret euthanatized omedelbart. Om, på dag 4 efter sändare implantation, visar djuret tydliga tecken på apati, är extremt aggressiv eller inte visar någon mat intag bör det euthanatized omedelbart. På dag 8 efter sändare implantationen, har djuret för att visa en tydlig ökning i kroppsvikt i jämförelse med den föregående postoperativa dagar. Dessutom har det att konsumera på löster 80% av den preoperativa dagliga matintag. Om något av dessa villkor inte är uppfyllt, bör djuret euthanatized omedelbart. Vid 10 dagar efter implantation, är djuret flyttas tillbaka till djuret rummet under normala bostadsförhållanden. Möss ska hållas i kompatibla grupper för att möjliggöra social interaktion och för att förhindra de negativa effekterna av långvarig enskilda bostäder, som kan ha betydande konsekvenser för avläsning av efterföljande experiment 8, 9. Möss bör ha en period av minst 4 veckor konvalescens efter sändare implantation innan det första experimentet utförs och datainsamling börjar. 4. Datainsamling Datainsamling initieras genom att röra djuret med en magnet, varefter sändaren är påslagen. Dataquest ART Software (Data Sciences International, St Paul, MN, USA) samordnar upptäckt, insamling, analys och graphical presentation (i form av vågformer) av signaler från en eller flera djur. Förvärvet Programmet samlar in data signaler som skickas till datorn från konverterare och mottagare via en Data Exchange Matrix (Data Sciences International). Detta program kan antingen samla in data för en viss tid med jämna mellanrum eller prova kontinuerligt och spara data på datorns hårddisk. Eftersom utbudet och kvaliteten på den utsända signalen är starkt beroende av materialsammansättning på buren och omgivande utrustning (t.ex. metall mot plast), föreslås att mottagaren plattan placeras så nära djuret som möjligt, t.ex. inom ramen för djurens bur eller över försöksområdet, t.ex. laboratorium bänk eller löpband. Det rekommenderas att korrekt konfiguration av inspelningen och dataöverföring systemet kontrolleras genom att göra en kort genomgång av realtids-mätningar i kontinuerlig provtagning läge. När data har samlats in och lagrats, kan de vara tomtTed, listas och analyseras för en mängd olika parametrar med Analysis programmet. Information om konfiguration av inspelningen systemet (t.ex. definiera provtagning modus) och analysprogram (t.ex. för variabilitet hjärtfrekvens parametrar, PQ intervall och QT-intervallet etablerad från biopotential / EKG-kurvor) finns i tillverkarens manualer. Värdefulla tips för biometriska planering och statistiska metoder användbara för telemetrisk datainsamling och tolkning är publicerade på annat håll 3. 5. Representativa resultat: En övergripande plan för den beskrivna metoden visas i figur 1. Placeringen av den implanterade sändare, inklusive placeringen av elektroderna för att få biopotentialer från hjärtat (en-avlednings EKG) visas i figur 2. Exempel på rådata från kortsiktiga biopotential kurvor (en-avlednings-EKG), och långsiktig hjärtfrekvensen, kroppstemperaturen och motorisk inspelningar aktivitet för den enskildamöss ges i Figur 3 och Figur 4, respektive. Figur 5 ger ett exempel på publicerade data från långtidsmätningar i grupper av möss efter ett experiment. Flera andra parametrar kan fastställas från biopotentialer kurvor. Exempel på presentation av variabilitet hjärtfrekvens parametrar 5, QT-intervallet och PQ intervall 10, 11 publicerats på annat håll. Tabell 1. Allmän kondition och hälsa dataövervakning ark. Klicka här för att ladda arket. här mallen underlättar övervakning av en enskild mus allmänna kondition och hälsa. Baseline undersökning av ett djurs utseende, hållning, och spontant beteende, samt bestämning av kroppsvikten, och mat och vattenförbrukning måste fastställas innan implantationskirurgi gång per dag i 3 dagar. Jämförelse av baslinjen bestämningar med de som erhållsdagligen i 10 dagar efter operation användas för att bedöma utvecklingen av postoperativ återhämtning. Dessutom postoperativ vård och smärtbehandling väl dokumenterad i form av en journal. Instruktioner för humana slutpunkter ges för att underlätta beslut om huruvida en mus ska offras för att förhindra onödig smärta och lidande, om djuret inte uppfyller kriterierna för snabb återhämtning efter implantation. Figur 1. Schema för upprättandet telemetrisk-sändare-bärande möss. Kronologisk ordning förfaranden för implantation av en sändare som visar tiden punkter där en mus kan användas för experiment och datainsamling. Figur 2. Röntgenbild / skiss som visar placeringen av implanterade telemetry sändare. Kroppen av sändaren är placerad i bukhålan. Pluskabeln formas till en tråd slinga och fast i xiphoid processen med suturer. Den negativa bly tunnel subkutant från bröstkorgen till nacken och fastställas som en tråd slinga mellan musklerna direkt anslutning till luftstrupen. Den röntgenbild tas från författarnas tidigare publikation hos försöksdjur 9. Figur 3. Biopotential kurvor. Raw utskrift av en-avlednings EKG kurvor från en medveten mus och av samma djuret under inhalationsanestesi med sevofluran. Pulsen beräknas automatiskt av telemetri system. Det 3-sekvens inspelad under narkos innebär en puls på 440 slag per minut. Kurvan registreras i den medvetna mus visar en puls på 660 bpm, vilket faller inom det förväntade intervallet för hjärtfrekvens under-lägetakt fysiska aktiviteter såsom trimning eller äta. Från biopotential / en-avlednings EKG-kurvor, hjärtfrekvens parametrar föränderlighet, interbeat intervallet och PQ och QT-intervall kan fastställas med användning av tillverkarens programvara. Figur 4. Rådata från långsiktiga mätningar i friska och sjuka möss. Puls (BPM), kroppstemperaturen (° C) och rörelseaktivitet (räknar) mäts, medan möss förvaras separat i deras hem buren utan störning från människa eller experimentella procedurer. Pulsen registreras i 30 sekunder var 5 minuter (samplingsfrekvens 1000 Hz). Kroppstemperaturen samplas i 10 sekunder var 5 minuter. Rörelseaktivitet registreras kontinuerligt och lagras med 5 minuters mellanrum. Fem minuters datapunkter spåras för 6,5 dagar. Den telemetriska mätningar är inspelade från tre möss med olikakroppsliga förhållanden. Den hälsosamma mus visar en tydlig dygnsrytm med normala ökningar i fysiologiska värden och rörelseaktivitet beteende under den mörka (natt) fas. Däremot efter större operation, är hjärtklappning, särskilt i dagsljus fas och rörelseaktivitet är deprimerad. Den tredje musen lidit av kronisk tumörsjukdom-sin dygnsrytm av hjärtfrekvensen och kroppstemperaturen visas tillplattad och rörelseaktivitet minskar. Representativa uppgifter av mätningar hjärtfrekvensen (normala värden och efter en större operation) är hämtade från författarnas tidigare offentliggjorts i Altex 12. Figur 5. Exempel på presentation av resultat från långvarig telemetri mätningar efter ett experiment. Siffran är hämtad från författarnas tidigare publikation hos försöksdjur 1. Som ett föredömligt experiment, en 50-minuters isoflurane eller sevoflurananestesi utfördes. Den långsiktiga effekten av anestetika på hjärtfrekvensen, kroppstemperaturen och rörelseaktivitet efter det att djuren var vakna jämfördes. Med 16 sändare-implanterade möss var telemetriska uppgifter i åtta möss per bedövning medan djuren var ensamstående hålls och tillåtas att röra sig fritt i sitt hem burar. För analys av långsiktiga postanesthetic effekter, tog vi hänsyn till att värdena varierar kraftigt under en 24-h cykel eftersom möss är aktiva huvudsakligen nattetid. Därför var de hjälp av telemetriska värden för varje djur beräknas separat för natten (12 h mörk) och dag (12 timmar ljus) faser. En individs normala värden fastställdes genom att beräkna medel från tre dagar före anestesi. För varje dag efter anestesi, var medelvärdet av de mörka och ljusa fasen jämfört med individens normala värden, vilket resulterar i deltat värden. Således Deltavärde representerar avvikelse från normala värden (fastställt innantill anestesi) på motsvarande 12 h dag och natt tid. Kolumnerna representerar medelvärdet från åtta möss, staplar visar standardavvikelse. Asterisker indikerar signifikans vid p ≤ 0,05 (Enkelresa variansanalys för jämförelse av grupp medel som var och en av fyra dagar efter anestesi med normala värden).