Животное эксперимент был одобрен кантональной ветеринарной службы (Цюрих, Швейцария). Жилищно-экспериментальных процедур в соответствии со швейцарским законодательством о защите животных и соответствуют европейской директиве о защите животных, используемых в научных целях (ДИРЕКТИВА 2010/63/EU ЕВРОПЕЙСКОГО ПАРЛАМЕНТА И СОВЕТА от 22 сентября 2010 года). 1. Предоперационная соображений 1,1 Мыши: жилищные потребности, общее состояние здоровья и мониторинга Рекомендуется, чтобы избавиться от мышей поставщиков или переведены из внешних колоний грызунов должны прибыть в субсидированного жилья по крайней мере за две недели до операции. Этот период должен позволять животным, чтобы адаптироваться к новой среде и по конкретным объектам жилищных условий. Мыши, как социальные животные, живущие, должны быть размещены в совместимых групп в течение этого периода адаптации. Для контроля уровня индивидапродукты питания и потребления воды, каждая мышь располагается отдельно от 3 дней до операции до 10 дней после хирургической имплантации передатчика. Тайм-линии для установления телеметрического передатчика мышей показано на рисунке 1. Очень важно, чтобы животные приходят к операции в добром здравии и состоянии. Поэтому, до операции, животных следует контролировать один раз в день в течение 2-3 дней, касающиеся общего состояния (внешний вид, осанка, спонтанное поведение), а также для массы тела, потребление корма и воды. Эти данные документируются на медицинские записи (общее состояние здоровья и данные мониторинга лист, таблица 1) установить индивидуальные сравнению с исходным уровнем общего самочувствия и общего состояния здоровья и благополучия. Любые животные появились симптомы заболевания или нарушения общего состояния до операции должны быть исключены из эксперимента. 1,2 Волосы отсечения на один день до операции День до имплантации, для того, чтобы побриться Animлов для хирургии, анестезии мышей кратко в небольших (8x8x8cm) Perspex камеры использованием севофлурана (8%) или изофлуран (5%) в чистом кислороде (600 мл / мин). После потери рефлекса, мышей вынимают из камеры и передние волосы шеи и брюшной обрезается с животным лежащего в спинной отдохновение; анестезии сохраняется в течение приблизительно 5 минут нос маску с севофлурана 3-4% или изофлуран 1,5-3% в чистом кислороде при расходе 600 мл / мин. После отсечения волосы, животные могут находиться, чтобы пробудить, а затем вернулись в свои родные клетки. 2. Имплантация 2,1 Требования к окружающей среде, подготовка телеметрического передатчика В день имплантации, все процедуры, касающиеся подготовки передатчика и операции осуществляются на верстак с капюшоном ламинарного потока оснащен хирургический микроскоп. Асептические условия обеспечивается использование автоклавного instrumродителей и стерилизовать материалов и дезинфицирующих верстак 7. До имплантации, телеметрические передатчики (ETA-F10, Data Sciences International, Сент-Пол, Миннесота, США) являются первыми готовы. После удаления из их стерильной упаковке, приводит передатчика укорачиваются до длины подходит для размеров мыши для имплантации. В большинстве взрослых беспородных или инбредных мышей, красный электрод может быть сокращен до примерно 42 мм и белый / бесцветный электрод длиной около 55 мм. Изоляция трубы удаляется из дистальных (сенсорная) часть ведет: около 20 мм труб удаляется из красного электрода, около 10 мм труб удаляется из белого / бесцветный электрода. Дистальной части каждого электрода (в настоящее время без трубки) формируется в петлю, фиксируя конец с тонкой нити шелка (Perma-Handseide, 6-0, Ethicon, Нордерштедт, Германия). После подготовки электродов, передатчик находится в вагт стерильного физиологического раствора готовы быть имплантированы когда животное находится под наркозом и хирургическим подготовлены. 2,2 Анестезия На 5-10 минут до индукции ингаляционной анестезии, смесь мидазолама (4 мг / кг) и фентанила (0,04 мг / кг) вводят подкожно в качестве премедикации, обеспечивая тем самым седации и упреждающей анальгезии. Общая анестезия ингаляции индуцирована путем размещения животного в камере индукции и внедрение летучего анестетика (севофлурана 8% или 5% изофлуран в чистом кислороде 600 мин мл /). Когда животное показывает потерю рефлекса он переносится на верстаке под капотом ламинарного потока, и помещен в спинной отдохновение по специально разработанной металлической пластины оснащены маски нос и трубки из наркоза аппарат. Анестезия поддерживается за счет спонтанного дыхания (севофлурана 3-4% и 1,5-3% изофлуран в чистом кислороде при расходе 600 мл / мин). Во время наркоза, глаз животногоы защищены мазь (витамин А, Baush & Lomb, Steinhausen, Швейцария). Лежа на металлическую пластину животных нагревается от водяной бане нагревают поверхность (39 ° C + / -1) из верстаке. 2,3 хирургии Кожу передней части шеи и брюшной обеззараживается с 70% этанола. 1 – до 1,5 см длиной разрез в коже производится из нижней грудной клетки вдоль средней линии на животе. Отрицательный (белый / бесцветный) свинец туннель подкожно от грудной клетки к шее, где маленький разрез (≤ 0,5 см) выполнен в продольном направлении. Кожи и подлежащих тканей готовы освободить место для фиксации проволочной петли электрода. Проволочная петля фиксируется между мышцы расположены справа от трахеи, с помощью двух тонких нитей шелка (Perma-Handseide, 6-0, Ethicon, Нордерштедт, Германия). Раной в области шеи затем закрывается с рассасывающиеся нити (Викрил 6-0, Ethicon, Нордерштедт, Германия) в слоях. Брюшной стенки, затем открылся в белой линии и тело телеметрического передатчика помещается в брюшную полость мыши. Проволоки петлю положительный (красный) электрод пришита к мечевидного отростка с шелковыми швами таким образом, что она лежит между печенью и диафрагмой в левой верхней области живота (рис. 2). Затем мышцы слоями брюшной области закрыты рассасывающиеся нити (Викрил 6-0, Ethicon, Нордерштедт, Германия). До окончательного закрытия брюшной стенки, смесь Sulfadoxin и триметоприм [(30 мг / кг и 6 мг / кг, соответственно; растворяют в 1 мл физиологического раствора (0,9%) и находится примерно температуры тела (38-39 ° С)] вводится в брюшную полость для целей антиинфекционной профилактики и поддерживать гомеостаз жидкости. Наконец, кожа брюшной области восстанавливается с помощью скоб (Точные, 3 M здравоохранения, Сент-Пол, Миннесота, США). 3. Послеоперационный уход После завершения операции и анестезии, 0,1 мг / кг бупренорфина (Temgesic, Essex Chemie AG, Люцерн, Швейцария) и 5 ​​мг / кг мелоксикама (Metacam, Boehringer Ingelheim, Базель, Швейцария) вводят подкожно для снятия болевого синдрома, а также животные остаются на теплой (39 ° C + / -1) поверхности верстак, чтобы восстановить в течение примерно 2 часов. Вместе с боли (два раза в день: бупренорфин, 0,1 мг / кг и мелоксикам 5 мг / кг), поддерживающая терапия, состоящая из 300 мкл глюкозы (5%) и 300 мкл физиологического раствора (0,9%), подогреть до температуры тела, применяется подкожно в два раза ежедневно в течение 4 дней. Для дальнейшей поддержки восстановления, стоит обеспечение животных с дополнительной бутылкой питьевой, содержащей 15% раствора глюкозы. Во время восстановительного периода в 4-10 дней, рекомендуется, чтобы животные в тепле. Таким образом, в нашем случае, мышей размещены в шкафу потепление (30 ° C + / – 1). Мониторинг общего состояния и веса тела, аа также потребление пищи и воды, проводится один раз в день в зависимости от общего состояния здоровья и мониторинга данных листа (табл. 1) в течение 10 дней после операции. Гуманное конечных точек, то есть жертву животное, чтобы избежать ненужных страданий и боли, если прогрессирование восстановления является неудовлетворительным, осуществляется при соблюдении следующих условий: Если в плохом общем состоянии, т.е. животных существенно апатичным (без движения после того, как коснулся / нажата) и ее поверхность тела чувствует холод, несмотря на потепление, животное должно быть euthanatized немедленно. Если, с 4-й день после имплантации передатчик, животное проявляет явные признаки апатии, чрезвычайно агрессивные или не показывает приема пищи, она должна быть euthanatized немедленно. На 8-й день после имплантации передатчик, животное должно проявлять четкое увеличение массы тела по сравнению с предыдущим послеоперационных дней. Более того, он должен потреблять в лвосток 80% дооперационном ежедневного рациона питания. Если одно из этих условий не выполняется, животное должно быть euthanatized немедленно. В течение 10 дней после имплантации, животное передается обратно в комнату животных в стандартных условиях жилья. Мыши должны быть размещены в совместимых групп, чтобы социальные взаимодействия и, чтобы предотвратить негативные последствия долгосрочного индивидуального жилья, которые могут иметь существенное влияние на считывание последующих экспериментах 8, 9. Мыши должны иметь срок не менее 4 недель после выздоровления передатчик имплантации перед первым эксперимент проводится и сбора данных начинается. 4. Сбор данных Сбор данных проводится по инициативе трогательное животное с магнитом, после чего передатчик включен. Dataquest ART Software (Data Sciences International, Сент-Пол, Миннесота, США) координаты обнаружения, сбора, анализа и грaphical презентации (в виде волновых форм) сигналов от одного или нескольких животных. Приобретение программа собирает данные сигналы, посылаемые к компьютеру, на преобразователи и приемники с помощью Data Exchange Matrix (Data Sciences International). Эта программа может либо собирать данные в течение определенного периода времени, через равные промежутки времени или образец непрерывно и сохранения данных на жестком диске компьютера. Как диапазон и качество излучаемого сигнала сильно зависит от вещественного состава клетки и окружающего оборудования (например, металла против пластика), предполагается, что приемник пластина помещается как можно ближе к животным это возможно, например, под животных клетку или выше экспериментальной области, например лабораторном столе или беговой дорожке. Рекомендуется правильной конфигурации системы передачи записи и данные будут проверены, делая короткие рассмотрение измерений в реальном времени в режиме непрерывного отбора проб. После того как данные были собраны и хранятся, они могут быть заговорТед, перечислены и проанализированы различные параметры с помощью анализа программы. Подробная информация о конфигурации системы записи (например, определение выборки модус), а также программное обеспечение для анализа (например, для вариабельности сердечного ритма параметров, PQ интервала QT интервала и установить по биопотенциалов / ЭКГ кривые) можно найти в руководствах производителя. Ценные советы для биометрических планирования и статистические методы, полезные для телеметрического сбора данных и интерпретации опубликованы в другом месте 3. 5. Представитель Результаты: Общая схема описанная процедура показана на рисунке 1. Положение имплантировали передатчик, в том числе расположение электродов для получения биопотенциалов от сердца (одно-канальной ЭКГ) показан на рисунке 2. Примеры исходных данных от краткосрочных кривых биопотенциалов (одно-канальной ЭКГ) и долгосрочных сердечных сокращений, температуры тела и двигательной активности отдельных записеймышей приведены в рисунках 3 и 4, соответственно. На рисунке 5 приведен пример опубликованы данные из долгосрочных измерений в группах мышей после эксперимента. Некоторые другие параметры могут быть установлены с биопотенциалов кривых. Примеры для представления вариабельности сердечного ритма параметров 5, QT интервала и интервала PQ 10, 11 опубликованы в другом месте. Таблица 1. Общее состояние здоровья и данные мониторинга листа. Нажмите здесь, чтобы загрузить лист. Этот шаблон облегчает мониторинг общего состояния отдельных мыши и здоровья. Базовое обследование появления животного, поза, и спонтанное поведение, а также определение массы тела, а потребление корма и воды должны быть установлены до имплантации операцию один раз в день в течение 3 дней. Сравнение базовых определений с результатами, полученнымиежедневно в течение 10 дней после операции служат для оценки прогрессирования послеоперационного восстановления. Кроме того, послеоперационный уход и лечение боли хорошо документированы в виде болезни. Инструкции по гуманным конечные точки даны для того, чтобы облегчить принятие решений о том, мышь должна быть принесена в жертву, чтобы предотвратить ненужную боль и страдания, если животное не отвечает критериям для быстрого восстановления после имплантации. Рисунок 1. Расписание для установления телеметрического передатчика мышей. Порядок проведения процедур, связанных с имплантацией передатчиков, показывающая время точки, в которых мышь можно использовать для экспериментов и сбора данных. Рисунок 2. Рентгенограмма / эскиз с указанием местонахождения имплантированных telemetры передатчика. Тело передатчик расположен в брюшной полости. Положительный вывод формируется в проволочную петлю и крепится к мечевидного отростка со швами. Отрицательный провод туннелируется подкожно от грудной клетки к шее и фиксируется как проволочную петлю между мышцами в непосредственной близости от трахеи. Рентгенограмма взята из авторов предыдущей публикации на лабораторных животных 9. Рисунок 3. Биотоки кривых. Сырье распечатку одной привести кривые ЭКГ от сознательного мыши и того же животного при ингаляционной анестезии с севофлурана. Частота сердечных сокращений рассчитывается автоматически с помощью телеметрической системы. 3-второй последовательности записаны под наркозом указывается частота сердечных сокращений 440 ударов в минуту. Кривая записан в сознательном мыши показывает частоту сердечных сокращений 660 ударов в минуту из, который попадает в ожидаемый диапазон для частоты сердечных сокращений во время режимаСкорость физической деятельности, такой как уход или еды. С биопотенциалов / одна привести кривые ЭКГ, сердце параметры вариабельности ритма, interbeat интервала PQ и QT интервалы и могут быть установлены с использованием программного обеспечения фирмы-производителя. Рисунок 4. Необработанные данные от долгосрочных измерений в здоровых и больных мышей. Сердечный ритм (уд), составляющего ядро ​​температура (° С) и двигательную активность (рассчитывает) измеряются в то время как мыши расположены по отдельности в их доме клетку без каких-либо нарушений у человека или экспериментальных процедур. Сердечный ритм регистрируется в течение 30 секунд каждые 5 минут (частота дискретизации 1000 Гц). Температура тела выборка в течение 10 секунд каждые 5 минут. Двигательную активность записывается непрерывно и хранят при 5-минутными интервалами. Пять минут точек данных, прослеживаются на 6,5 дней. Телеметрических измерений записываются с трех мышей с различнымителесными условиями. Здоровые мыши, показывают четкий суточный ритм с нормальной увеличением физиологических значений и опорно-двигательного поведения активность в темное время (ночью) фазы. В противоположность этому, после серьезной операции, частота сердечных сокращений увеличивается, особенно в дневное фазу, и двигательная активность является депрессия. Третий мыши страдали от хронических опухолевых заболеваний, его циркадный ритм частоты сердечных сокращений и температуры тела появляется плоский, и двигательная активность снижается. Представитель данных измерений частоты сердечных сокращений (нормальные значения и после серьезной операции) взяты из авторов предыдущей публикации в Альтекс 12. Рисунок 5. Пример представления результатов от долгосрочных телеметрических измерений после эксперимента. Рисунок взят из авторов предыдущей публикации на лабораторных животных 1. Как образцовая эксперимента, 50-минутный isoflurane или севофлурана анестезия была выполнена. Долгосрочного воздействия анестетиков на частоту сердечных сокращений, температуры тела и двигательную активность после того, животные проснулись было сравнивать. Использование 16 приемо-имплантированных мышам, телеметрические данные были зарегистрированы в восьми мышей в анестезии в то время как животные одного жилья, и разрешили свободно перемещаться в своих клетках дома. Для анализа долгосрочных последствий посленаркозный, мы приняли во внимание, что значения сильно различаются в течение 24-часового цикла с мышами активны в основном ночью. Таким образом, средства телеметрических значений для каждого животного были рассчитаны отдельно по ночам (12 ч темный) и день (12 часов света) фаз. Нормальных значений человека были установлены средства из расчета три дня до анестезии. За каждый день после анестезии, среднее темных и светлых фазы по сравнению с нормальными значениями человека, в результате чего дельта ценностей. Таким образом, дельта-значения представляют собой отклонение от нормальных значений (созданных додля анестезии) в соответствующий 12 ч дневное и ночное время. Столбцы представляют собой среднее из восьми мышей; полоски указывают на стандартное отклонение. Звездочки указывают значение при Р ≤ 0,05 (в одну сторону дисперсионного анализа для сравнения группы означает в каждом из четырех дней после анестезии с нормальными значениями).