Implantação de Transmissores de radiotelemetria Cedendo Dados sobre ECG, freqüência cardíaca, temperatura corporal e atividade em camundongos de laboratório de movimento livre

O experimento animal foi aprovado pelo Serviço Cantonal Veterinário (Zurique, Suíça). Habitação e procedimentos experimentais foram de acordo com a lei suíça Animal Protection e em conformidade com a Directiva Europeia sobre a Protecção dos Animais utilizados para fins científicos (DIRECTIVA 2010/63/EU DO PARLAMENTO EUROPEU E DO CONSELHO de 22 de Setembro de 2010). 1. Considerações pré-operatórias 1,1 Mice: Requisitos de habitação, condições gerais e vigilância da saúde Recomenda-se que os ratos entregues a partir de fornecedores ou transferidos de colônias de roedores externas devem chegar à instalação de alojamento, pelo menos, duas semanas antes da cirurgia. Este período deve permitir aos animais para se adaptar ao novo ambiente e as condições específicas de instalação de habitação. Camundongos, os animais que vivem social, devem ser alojados em grupos compatíveis durante este período de adaptação. Para monitoramento do nível de um indivíduo dealimentos e consumo de água, cada rato é alojados individualmente partir de 3 dias antes da cirurgia até 10 dias após o implante cirúrgico transmissor. A linha do tempo para o estabelecimento de telemetria-transmissor-rolamento ratos é mostrada na Figura 1. É crucial que os animais vêm à cirurgia de boa saúde e condição. Portanto, antes da cirurgia, os animais devem ser monitorados uma vez por dia durante 2-3 dias sobre o estado geral (aparência, postura, comportamento espontâneo), bem como para o peso corporal, consumo de alimentos e água. Estes dados são documentados em um registro médico (condição geral de saúde e monitoramento folha de dados, Tabela 1) para estabelecer níveis basais individuais do estado geral e de saúde geral e bem-estar. Todos os animais que apresentem sintomas de doença ou condição geral comprometida antes da cirurgia devem ser excluídos do experimento. 1,2 clipping cabelo, um dia antes da cirurgia O dia antes da implantação, a fim de raspar a animals para a cirurgia, os ratos são anestesiados rapidamente em uma pequena câmara de Perspex (8x8x8cm), utilizando sevoflurano (8%) ou isoflurano (5%) em oxigênio puro (600 mL / min). Após a perda do reflexo de endireitamento, o mouse é retirado da câmara e os pêlos do pescoço e abdominal anterior é cortado com o animal deitado em decúbito dorsal, anestesia é mantida por cerca de 5 minutos com uma máscara de nariz com 3-4% ou sevoflurano 1,5-3% isoflurano em oxigênio puro a uma vazão de 600 mL / min. Após o corte do cabelo, os animais são permitidos para despertar e depois são trazidos de volta para sua gaiola. 2. Implantação 2,1 Ambiente de funcionamento, a preparação do transmissor de telemetria No dia da implantação, todos os procedimentos relativos à preparação do transmissor e cirurgia são realizados em uma bancada de trabalho com uma capela de fluxo laminar equipada com um microscópio cirúrgico. Condições assépticas são assegurados pela utilização de instrum autoclavadopais e materiais esterilizados e desinfecção da bancada de trabalho 7. Antes da implantação, os transmissores de telemetria (ETA-F10, Data Sciences International, St. Paul, MN, EUA) são os primeiros preparados. Após a remoção do seu pacote estéril, a leva do transmissor são encurtados para um comprimento adequado para o tamanho do mouse para ser implantado. Na maioria dos adultos ratos outbred ou puras, o eletrodo vermelho pode ser reduzido para cerca de 42 mm eo eletrodo branco / incolor a um comprimento de aproximadamente 55 mm. Tubulação de isolamento é removido da peça (sensorial) distal das ligações: cerca de 20 mm de tubulação é removida do eletrodo de vermelho, cerca de 10 mm de tubulação é removida do eletrodo branco / incolor. A parte distal de cada eletrodo (que agora está sem tubulação) é formada em um loop, fixando o final com fio de seda fina (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Alemanha). Depois de preparar os eletrodos, o transmissor é colocado em wasalina estéril rm pronto para ser implantado quando o animal é anestesiado e cirurgicamente preparado. 2,2 Anestesia Em 5-10 minutos antes da indução da anestesia inalatória, uma mistura de midazolam (4 mg / kg) e fentanil (0,04 mg / kg) são pré-medicação administrada por via subcutânea, proporcionando sedação e analgesia preemptiva. Anestesia inalatória geral é induzido pela colocação do animal na câmara de indução e introduzindo o agente anestésico volátil (8% sevoflurano ou 5% de isoflurano em oxigênio puro min ml / 600). Quando o animal apresenta perda do reflexo de endireitamento é transferido para a bancada de trabalho sob a capela de fluxo laminar, e colocado em decúbito dorsal sobre uma placa de metal especialmente concebidos equipado com uma máscara de nariz e tubo do aparelho de anestesia. A anestesia é mantida pela respiração espontânea (3-4% 1,5-3% sevoflurano ou isoflurano em oxigênio puro a uma vazão de 600 mL / min). Durante olho anestesia, o animals são protegidos com pomada (Vitamina A, Baush & Lomb, Steinhausen, Suíça). Enquanto estava deitado na placa de metal que o animal é aquecido pela superfície aquecida em banho-maria (39 ° C + / -1) da bancada de trabalho. 2,3 Cirurgia A pele da região abdominal anterior do pescoço e é desinfetada com álcool 70%. A 1 – incisão de 1,5 cm de comprimento na pele é feita a partir do mais baixo ao longo da linha média do tórax ao abdômen. O chumbo (branco / incolor) negativo é tunnelled subcutânea do tórax para o pescoço, onde uma pequena incisão (≤ 0,5 cm) é feita no sentido longitudinal. A pele e tecidos subjacentes estão preparados para fazer espaço para a fixação da alça de arame do eletrodo. O laço de arame é fixo entre os músculos localizados à direita da traquéia, utilizando duas suturas de seda fina (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Alemanha). A ferida no pescoço é então fechada com suturas absorvíveis (Vicryl 6-0, Ethicon, Norderstedt, Alemanha), em camadas. A parede abdominal é, então, abriu na linha alba e do corpo do transmissor de telemetria é colocado dentro da cavidade abdominal do mouse. O laço de arame do eletrodo (vermelho) positivo é suturada ao apêndice xifóide com fio de seda, de tal maneira que fica entre o fígado eo diafragma na região abdominal superior esquerdo (Figura 2). Então, as camadas musculares da região abdominal são fechadas com suturas absorvíveis (Vicryl 6-0, Ethicon, Norderstedt, Alemanha). Antes de finalmente fechamento da parede abdominal, uma mistura de Sulfadoxin e Trimetoprima [(30 mg / kg e 6 mg / kg, respectivamente; dissolvido em 1 mL de solução salina (0,9%) e em cerca de temperatura corporal (38-39 ° C)] é injetado na cavidade abdominal para fins de profilaxia anti-infecciosa e apoiar a homeostase dos fluidos. Finalmente, a pele da região abdominal é restaurado com grampos (Precise, 3 Cuidados de Saúde M, St. Paul, MN, EUA). 3. Cuidados pós-operatório Após a conclusão da cirurgia e anestesia, 0,1 mg / kg de buprenorfina (Temgesic, Essex Chemie AG, Lucerne, Suíça) e 5 mg / kg de meloxicam (Metacam, Boehringer Ingelheim, Basel, Suíça) é administrado por via subcutânea para tratamento da dor, e os animais são deixados na água morna (39 ° C + / -1) superfície da bancada de trabalho para se recuperar por aproximadamente 2h. Juntamente com o alívio da dor (duas vezes por dia: buprenorfina, 0,1 mg / kg e meloxicam 5 mg / kg), terapia de apoio composta por 300 mL de glicose (5%) e 300 mL solução salina (0,9%) aquecida à temperatura corporal, é aplicada por via subcutânea duas vezes por dia durante 4 dias. Para apoiar a recuperação ainda mais, vale a pena fornecer os animais com uma garrafa de água adicional contendo solução de glicose a 15%. Durante o período de recuperação de 10/04 dias, é recomendado que os animais são mantidos quentes. Portanto, no nosso caso, os ratos estão alojados em um gabinete de aquecimento (30 ° C + / – 1). Monitoramento do estado geral e do peso corporal, comobem como o consumo de alimentos e água, é realizada uma vez por dia de acordo com o estado geral de saúde e folha de dados de monitoramento (Tabela 1) durante 10 dias pós-operatório. Endpoints humano, ou seja, o sacrifício de um animal para evitar a dor e sofrimento desnecessários se a progressão de recuperação não é satisfatória, são realizados sob as seguintes condições: Se estiver em mau estado geral, ou seja, o animal é substancialmente apático (sem movimento após ser tocado / empurrada) e sua superfície corpo sente frio apesar do aquecimento, o animal deve ser sacrificado imediatamente. Se, no dia 4 após a implantação do transmissor, o animal mostra sinais claros de apatia, é extremamente agressivo ou não mostrar qualquer ingestão de alimentos, que devem ser sacrificados imediatamente. No dia 8 após a implantação do transmissor, o animal tem para mostrar um claro aumento no peso corporal em comparação com os anteriores pós-operatório. Além disso, ele tem que consumir em la leste de 80% do consumo de alimentos pré-operatório diariamente. Se uma dessas condições não for atendida, o animal deve ser sacrificado imediatamente. Menos 10 dias após o implante, o animal é transferido de volta para a sala de animais em condições de habitação standard. Camundongos devem ser alojados em grupos compatíveis para permitir a interação social e para evitar os efeitos adversos de longo prazo habitação individual, que pode ter impactos substanciais sobre a leitura de experimentos subseqüentes 8, 9. Ratos deve ter um período de pelo menos 4 semanas após a implantação convalescença transmissor antes do primeiro experimento é conduzido e aquisição de dados começa. 4. De aquisição de dados A coleta de dados é iniciado tocando o animal com um ímã, quando então o transmissor está ligado. Dataquest ART Software (Data Sciences International, St. Paul, MN, EUA) coordena a detecção, recolha, análise e grapresentação aphical (na forma de formas de onda) de sinais de um ou mais animais. O Programa de Aquisição de coleta sinais de dados enviados para o computador dos conversores e receptores através de uma troca de dados Matrix (Data Sciences International). Este programa pode coletar dados para um determinado período de tempo em intervalos regulares ou amostra continuamente e salvar os dados no disco rígido do computador. Como o alcance ea qualidade do sinal emitido depende fortemente da composição do material da gaiola e equipamento circundante (por exemplo, metal, plástico vs), sugere-se que a placa de receptor é colocado o mais próximo possível do animal quanto possível, por exemplo, sob o gaiola dos animais ou acima da área experimental de bancada de laboratório, por exemplo, ou esteira. Recomenda-se que a configuração correta do sistema de transmissão de gravação e os dados sejam verificados por fazer um pequeno exame de medições em tempo real no modo de amostragem contínua. Depois que os dados foram recolhidos e armazenados, eles podem ser enredoted, listados e analisados ​​para uma variedade de diferentes parâmetros usando o programa de análise. Detalhes da configuração do sistema de gravação (por exemplo, definir a amostragem modus), e software de análise (por exemplo, para os parâmetros de variabilidade da frequência cardíaca, PQ intervalo e intervalo QT estabelecida a partir de biopotencial / ECG curvas) podem ser encontradas nos manuais do fabricante. Dicas valiosas para o planejamento biométricos e métodos estatísticos úteis para a aquisição de dados de telemetria e interpretação são publicados em outros lugares 3. 5. Resultados representativos: Um esquema geral do procedimento descrito é mostrado na Figura 1. A posição do transmissor implantado, incluindo a localização dos eletrodos para a obtenção de biopotenciais do coração (um ECG) é mostrado na Figura 2. Exemplos de dados brutos de curto prazo curvas biopotencial (um ECG), e de longo prazo da freqüência cardíaca, temperatura corporal e gravações locomotor atividade do indivíduocamundongos são apresentados na Figura 3 e Figura 4, respectivamente. A Figura 5 apresenta um exemplo dos dados publicados a partir de medições a longo prazo em grupos de camundongos após uma experiência. Vários outros parâmetros podem ser estabelecidos a partir das curvas biopotenciais. Exemplos para a apresentação dos parâmetros da variabilidade da frequência cardíaca 5, intervalo QT e PQ intervalo de 10, 11 são publicados em outros lugares. Tabela 1. Estado geral de saúde e monitoramento folha de dados. Clique aqui para baixar a folha. Este modelo facilita o monitoramento do estado geral de um rato do indivíduo e da saúde. Exame inicial da aparência de um animal, postura e comportamento espontâneo, bem como a determinação do peso corporal e consumo de alimentos e água deve ser estabelecido antes da cirurgia de implantação, uma vez por dia durante 3 dias. Comparação de determinações basais com aqueles obtidospor dia durante 10 dias após a cirurgia serve para avaliar a progressão da recuperação pós-operatória. Além disso, cuidados pós-operatórios e tratamento da dor são bem documentados na forma de um registro médico. Instruções sobre endpoints humanitários são dadas, a fim de facilitar as decisões sobre se um rato deve ser sacrificado para evitar dor e sofrimento desnecessários se o animal não satisfaz os critérios para a rápida recuperação após o implante. Figura 1. Schedule para o estabelecimento de telemetria-transmissor-rolamento camundongos. Ordem cronológica dos procedimentos relativos à implantação de um transmissor mostrando os pontos de tempo em que um mouse pode ser usado para experiências e aquisição de dados. Figura 2. Localização Radiografia / esboço mostrando do Telemet implantadotransmissor ry. O corpo do transmissor é colocado na cavidade abdominal. O fio positivo é formado em um laço de arame e fixado ao apêndice xifóide com suturas. O polo negativo é encapsulado por via subcutânea do tórax para o pescoço e fixos como um laço de arame entre os músculos ao lado da traquéia. A radiografia é tirada a partir da publicação dos autores anteriores em animais de laboratório 9. Figura 3. Curvas biopotencial. Raw impressão de curvas de um ECG de um camundongo consciente e do mesmo animal sob anestesia inalatória com sevoflurano. A freqüência cardíaca é calculado automaticamente pelo sistema de telemetria. A seqüência de 3 segundos gravado sob anestesia indica uma freqüência cardíaca de 440 bpm. A curva registrada no consciente do mouse mostra uma freqüência cardíaca de 660 bpm, que cai dentro da faixa esperada para a frequência cardíaca durante o modotaxa de atividades físicas como grooming ou de comer. A partir de curvas biopotencial / um ECG, os parâmetros de variabilidade da freqüência cardíaca, de IBI, e PQ e intervalos QT pode ser estabelecida com o uso de software do fabricante. Figura 4. Raw dados de medições a longo prazo em ratos sadios e doentes. Freqüência cardíaca (bpm), temperatura corporal central (° C) e locomotor atividade (contagens) são medidos enquanto os ratos são alojados individualmente em sua gaiola de casa sem qualquer perturbação de procedimentos homem ou experimental. A freqüência cardíaca é registrada por 30 segundos a cada 5 minutos (frequência de amostragem 1000 Hz). Temperatura corporal central é amostrado por 10 segundos a cada 5 minutos. Atividade locomotora é registrado continuamente e armazenados em intervalos de 5 minutos. Pontos de cinco minutos dados são traçados para 6,5 ​​dias. As medições de telemetria são gravados a partir de três ratos com diferentescondições corporais. O rato saudável mostra um ritmo circadiano claro com o aumento normal em valores fisiológicos e comportamento da atividade locomotora durante a fase de (noite) escura. Em contraste, após uma grande cirurgia, a freqüência cardíaca aumenta, particularmente na fase de luz do dia, e atividade locomotora é deprimido. O mouse terceira sofria de crônica tumor ritmo circadiano sua doença da freqüência cardíaca e temperatura corporal central aparece achatada, e atividade locomotora é diminuída. Dados representativos de medidas a freqüência cardíaca (os valores normais e após cirurgia de grande porte) são tomadas a partir publicação dos autores anteriores em Altex 12. Figura 5. Exemplo de apresentação dos resultados de medições de longo prazo depois de um experimento de telemetria. O valor é retirado de publicação dos autores anteriores em animais de laboratório 1. Como uma experiência exemplar, uma isofl de 50 minutosanestesia urane ou sevoflurano foi realizada. O impacto a longo prazo dos anestésicos sobre a freqüência cardíaca, temperatura corporal e atividade locomotora após os animais estavam acordados foi comparado. Usando 16-transmissor implantado ratos, os dados de telemetria foram registrados em oito ratos por anestésico, enquanto os animais foram alojados individualmente e permitiu andar livremente em suas gaiolas de casa. Para análise dos efeitos a longo prazo pós-anestésica, levamos em conta que os valores variam muito, durante um ciclo de 24 h desde os ratos são ativos principalmente à noite. Portanto, as médias dos valores de telemetria para cada animal foram calculados separadamente para a noite (12 h escuro) e dia (12 h de luz) fases. Valores normais de um indivíduo foram estabelecidas por meio do cálculo dos três dias antes da anestesia. Para cada dia após a anestesia, a média da fase de claro e escuro foi comparado com os valores normais do indivíduo, resultando em valores delta. Assim, os valores delta representam o desvio dos valores normais (estabelecida antesà anestesia) no dia correspondente h 12 e período nocturno. Colunas representam a média de oito ratos; barras indicam o desvio padrão. Asteriscos indicam significância de P ≤ 0,05 (one-way análise de variância para comparação das médias dos grupos em cada um dos quatro dias após a anestesia com os valores normais).