L'esperimento animale è stato approvato dall'Ufficio cantonale di veterinaria (Zurigo, Svizzera). Alloggi e le procedure sperimentali in conformità del diritto svizzero sulla protezione degli animali e sono conformi alla direttiva europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (2010/63/EU DIRETTIVA DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO del 22 settembre 2010). 1. Pre-operatoria considerazioni 1,1 Mouse: esigenze abitative, condizioni generali e di monitoraggio della salute Si raccomanda che i topi consegnati dai fornitori o trasferite da colonie di roditori esterno dovrebbe arrivare alla struttura alloggiativa almeno due settimane prima dell'intervento. Questo periodo dovrebbe consentire agli animali di adattarsi al nuovo ambiente e di impianto, condizioni abitative. I topi, gli animali che vivono sociali, dovrebbero essere alloggiati in gruppi compatibili durante questo periodo di adattamento. Per il monitoraggio del livello di un individuo dicibo e consumo di acqua, ogni mouse è alloggiato singolarmente da 3 giorni prima dell'intervento chirurgico entro 10 giorni dopo l'impianto trasmettitore chirurgico. La linea del tempo per stabilire telemetrico-trasmettitore-cuscinetto topi è mostrato in Figura 1. E 'fondamentale che gli animali vengono a intervento chirurgico in buona salute e condizione. Pertanto, prima dell'intervento chirurgico, gli animali devono essere monitorati una volta al giorno per 2-3 giorni relative condizioni generali (aspetto, atteggiamento, comportamento spontaneo), così come per il peso del corpo, cibo e consumo di acqua. Questi dati sono documentati in una cartella clinica (stato di salute generale e la vigilanza scheda, tabella 1) per stabilire i livelli basali individuale delle condizioni generali e la salute generale e benessere. Tutti gli animali che presentano sintomi di malattia o compromissione delle condizioni generali prima dell'intervento chirurgico deve essere escluso dall'esperimento. 1,2 taglio dei capelli ad un giorno prima dell'intervento Il giorno prima dell'impianto, al fine di radere la animals per la chirurgia, i topi sono brevemente anestetizzati in un piccolo (8x8x8cm) camera di perspex con sevoflurano (8%) o isoflurano (5%) in ossigeno puro (600 ml / min). Dopo la perdita del riflesso di raddrizzamento, il mouse è preso dalla camera e il pelo anteriore del collo e dell'addome viene tagliata con l'animale che giace in recumbence dorsale; anestesia viene mantenuta per circa 5 minuti con una maschera nasale con sevoflurano al 3-4% o isoflurano 1,5-3% in ossigeno puro ad un flusso di 600 mL / min. Dopo il taglio dei capelli, gli animali sono autorizzati a risvegliare e vengono poi riportati alla loro gabbia a casa. 2. Impianto 2.1 Un ambiente operativo, la preparazione del trasmettitore telemetrico Il giorno di impianto, tutte le procedure riguardanti la preparazione del trasmettitore e la chirurgia sono effettuate su un banco da lavoro con una cappa a flusso laminare dotato di un microscopio operatorio. Condizioni asettiche sono assicurate dall'uso di Strum autoclavatogenitori e dei materiali sterilizzati e disinfezione banco di lavoro 7. Prima dell'impianto, i trasmettitori telemetrici (ETA-F10, Data Sciences International, St. Paul, MN, USA) sono prima preparato. Dopo aver rimosso dal loro confezione sterile, i cavi del trasmettitore si accorciano ad una lunghezza appropriata per le dimensioni del mouse per essere impiantato. Nella maggior parte dei topi adulti outbred o inbred, l'elettrodo rosso può essere ridotto a circa 42 mm e l'elettrodo bianco / incolore a una lunghezza di circa 55 mm. Tubo di isolamento viene rimosso dal distale (sensoriale), parte della porta: circa 20 mm di tubo viene rimosso dal elettrodo rosso, circa 10 mm di tubo viene rimosso dal elettrodo bianco / incolore. La parte distale di ciascun elettrodo (che ora è senza il tubo) si forma in un loop, fissando alla fine con suture di seta sottile (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt). Dopo aver preparato gli elettrodi, il trasmettitore viene inserito nella warm soluzione salina sterile pronto per essere impiantato, quando l'animale viene anestetizzato e preparato chirurgicamente. 2,2 Anestesia A 5-10 minuti prima dell'induzione dell'anestesia per inalazione, una miscela di midazolam (4 mg / kg) e fentanyl (0,04 mg / kg) sono somministrati per via sottocutanea come premedicazione, fornendo così sedazione e pre-emptive analgesia. L'anestesia generale inalatoria è indotta mettendo l'animale in camera di induzione e di introdurre l'agente anestetico volatile (sevoflurano 8% o isoflurano 5% in ossigeno puro 600 ml / min). Quando l'animale mostra una perdita del riflesso di raddrizzamento del suo trasferimento al banco di lavoro sotto la cappa a flusso laminare, e messo in recumbence dorsale su una piastra metallica appositamente dotato di una maschera e tubo dal naso dell'apparecchio di anestesia. L'anestesia è mantenuto dalla respirazione spontanea (3-4% sevoflurano o isoflurano 1,5-3% in ossigeno puro ad un flusso di 600 mL / min). Durante l'anestesia, l'occhio dell'animales sono protetti con unguento (vitamina A, Baush & Lomb, Steinhausen, in Svizzera). Mentre si trovava sulla piastra di metallo l'animale è riscaldata dal bagnomaria superficie riscaldata (39 ° C + / -1) del banco di lavoro. 2,3 Chirurgia La pelle della regione anteriore del collo e dell'addome viene disinfettata con il 70% di etanolo. A 1 – 1,5 cm di lunghezza un'incisione nella pelle è fatta dal torace basso lungo la linea mediana all'addome. Il negativo (bianco / incolore) piombo tunnel per via sottocutanea dal torace al collo, in cui si fa una piccola incisione (≤ 0,5 cm) in direzione longitudinale. La pelle e tessuti sottostanti sono disposti a fare spazio per il fissaggio del loop filo dell'elettrodo. Il ciclo filo è fissato tra i muscoli situati alla destra della trachea, con due punti di sutura in seta sottile (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt). La ferita al collo è poi chiusa con suture assorbibili (Vicryl 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germania) a strati. La parete addominale è quindi aperto alla linea alba e il corpo del trasmettitore telemetrico è posizionato nella cavità addominale del mouse. Il ciclo filo del positivo (rosso) elettrodo viene suturata al processo xifoideo con suture in seta in modo tale che si trova tra il fegato e il diaframma nella regione addominale superiore sinistro (Figura 2). Poi, gli strati muscolari della regione addominale sono chiusi con suture assorbibili (Vicryl 6-0, Ethicon, Norderstedt). Prima di chiudere definitivamente la parete addominale, una miscela di Sulfadoxin e Trimetoprim [(30 mg / kg e 6 mg / kg, rispettivamente; sciolto in 1 ml di soluzione fisiologica (0,9%) ed a circa temperatura corporea (38-39 ° C)] viene iniettato nella cavità addominale ai fini della profilassi anti-infettivi e per sostenere l'omeostasi dei fluidi. Infine, la pelle della regione addominale viene ripristinata con le graffette (Preciso, 3 M Health Care, St. Paul, MN, USA). 3. Assistenza post-operatoria Dopo il completamento di chirurgia e anestesia, 0,1 mg / kg di buprenorfina (Temgesic, Essex Chemie AG, Lucerna, Svizzera) e 5 mg / kg di meloxicam (Metacam, Boehringer Ingelheim, Basilea, Svizzera) viene somministrato per via sottocutanea per il trattamento del dolore, e la gli animali vengono lasciati al caldo (39 ° C + / -1) superficie del banco di lavoro per recuperare per circa 2 ore. Insieme al sollievo dal dolore (due volte al giorno: buprenorfina, 0,1 mg / kg e 5 mg di meloxicam / kg), terapia di supporto composto da 300 microlitri di glucosio (5%) e 300 microlitri soluzione salina (0,9%) riscaldata a temperatura corporea, viene applicato per via sottocutanea due volte al giorno per 4 giorni. Per sostenere la ripresa ulteriore, vale la pena fornendo gli animali con una borraccia contenente ulteriore soluzione di glucosio al 15%. Durante il periodo di recupero di 4-10 giorni, si raccomanda che gli animali sono tenuti al caldo. Pertanto, nel nostro caso, i topi sono alloggiati in un armadio riscaldamento (30 ° C + / – 1). Monitoraggio delle condizioni generali e di peso corporeo, comecosì come il consumo di cibo e acqua, viene eseguita una volta al giorno a seconda della condizione generale e la vigilanza foglio di dati sanitari (tabella 1) per 10 giorni dopo l'intervento. Gli endpoint umano, cioè il sacrificio di un animale al fine di evitare inutili sofferenze e il dolore se la progressione di recupero non è soddisfacente, sono realizzate alle seguenti condizioni: Se in cattive condizioni generali, cioè l'animale è sostanzialmente apatici (nessun movimento dopo essere stato toccato / spinta) e la sua superficie del corpo sente freddo nonostante il riscaldamento, l'animale deve essere immediatamente soppressi. Se, il giorno 4 dopo l'impianto trasmettitore, l'animale mostra chiari segni di apatia, è estremamente aggressivo o non mostra alcuna assunzione di cibo, deve essere immediatamente soppressi. Il giorno 8 dopo l'impianto trasmettitore, l'animale ha da mostrare un netto aumento del peso corporeo rispetto alla precedente post-operatorio giorni. Inoltre, è da consumare presso lest 80% dei pre-operatoria l'assunzione di cibo quotidiana. Se una di queste condizioni non è soddisfatta, l'animale deve essere immediatamente soppressi. A 10 giorni dopo l'impianto, l'animale è trasferito alla sala di animali in condizioni di stabulazione standard. I topi dovrebbero essere alloggiati in gruppi compatibili per permettere l'interazione sociale e per prevenire gli effetti negativi a lungo termine abitative individuali, che possono avere un impatto sostanziale sulla lettura di esperimenti successivi 8, 9. I topi devono avere un periodo di convalescenza di almeno 4 settimane dopo l'impianto trasmettitore prima che il primo esperimento è condotto e l'acquisizione dei dati inizia. 4. Acquisizione dati La raccolta dei dati è iniziata toccando l'animale con una calamita, dopo di che il trasmettitore è acceso. Dataquest Software Art (Data Sciences International, St. Paul, MN, USA) coordina l'individuazione, raccolta, analisi e grpresentazione aphical (sotto forma di forme d'onda) di segnali da uno o più animali. Il programma di acquisizione dati raccoglie i segnali inviati al computer dai convertitori e ricevitori tramite uno scambio Data Matrix (Dati Scienze Internazionali). Questo programma può raccogliere dati per un determinato periodo di tempo ad intervalli regolari o campione continuamente e salvare i dati sul disco rigido del computer. Poiché la gamma e la qualità del segnale emesso dipende fortemente dalla composizione del materiale della gabbia e delle attrezzature circostanti (ad esempio metallo vs plastica), si suggerisce che la piastra ricevitore è collocato il più vicino all'animale possibile, ad esempio sotto il gabbia animali 'o al di sopra della zona sperimentale, banco di laboratorio o ad esempio tapis roulant. Si raccomanda la corretta configurazione del sistema di registrazione e trasmissione dei dati da controllare facendo un breve esame delle misure in tempo reale in modalità di campionamento in continuo. Dopo i dati sono stati raccolti ed utilizzati, possono essere complottoTed, elencati e analizzati per una varietà di parametri diversi utilizzando il programma di analisi. Dettagli della configurazione del sistema di registrazione (ad esempio definire il modus di campionamento) e software di analisi (ad esempio per i parametri di variabilità della frequenza cardiaca, PQ intervallo e l'intervallo QT stabilito dalla biopotenziale / ECG curve) si possono trovare nei manuali del produttore. Indicazioni preziose per la pianificazione biometrici e metodi statistici utili per l'acquisizione dei dati telemetrici e l'interpretazione sono pubblicati altrove 3. 5. Rappresentante dei risultati: Uno schema generale della procedura descritta è mostrata in Figura 1. La posizione del trasmettitore impiantato, compresa la posizione degli elettrodi per ottenere biopotentials dal cuore (un ECG) è mostrato in Figura 2. Esempi di dati grezzi a breve termine biopotenziale curve (un ECG), ea lungo termine la frequenza cardiaca, temperatura corporea e le registrazioni locomotore attività dei singolii topi sono riportati nella Figura 3 e Figura 4, rispettivamente. La Figura 5 mostra un esempio di dati pubblicati da misure a lungo termine in gruppi di topi dopo un esperimento. Molti altri parametri possono essere stabiliti dalle curve biopotentials. Esempi per la presentazione dei parametri di variabilità della frequenza cardiaca 5, QT e PQ intervallo di 10, 11 sono pubblicati altrove. Tabella 1. Condizioni generali e di monitoraggio della salute scheda. Clicca qui per scaricare la scheda. Questo modello semplifica il monitoraggio delle condizioni generali di un mouse individuo e la salute. Esame di base di apparizione di un animale, la postura e comportamento spontaneo, così come la determinazione del peso corporeo, e il consumo di cibo e acqua deve essere stabilito prima dell'intervento chirurgico di impianto una volta al giorno per 3 giorni. Confronto di determinazioni di base con quelli ottenutial giorno per 10 giorni dopo l'intervento servono per valutare la progressione del recupero post-operatorio. In aggiunta, assistenza post-operatoria e terapia del dolore sono ben documentati nella forma di una cartella clinica. Istruzioni su endpoint umane sono dati al fine di facilitare decidere se un mouse dovrebbe essere sacrificato per evitare sofferenze e dolori non se l'animale non soddisfa i criteri per un veloce recupero dopo l'impianto. Figura 1. Pianificare per stabilire telemetrico-trasmettitore-cuscinetto topi. L'ordine cronologico delle procedure relative l'impianto di un trasmettitore che mostrano i punti ora in cui un mouse può essere utilizzato per esperimenti e acquisizione dati. Figura 2. Radiografia / schizzo posizione proiezione del Telemet impiantatory trasmettitore. Il corpo del trasmettitore è posizionato nella cavità addominale. Il polo positivo è formato in un loop filo e fissate al processo xifoideo con punti di sutura. Il polo negativo è incanalato per via sottocutanea dal torace al collo e fissato come un ciclo filo tra i muscoli direttamente accanto alla trachea. La radiografia è tratto dalla precedente pubblicazione degli autori 'in animali da laboratorio 9. Figura 3. Curve biopotenziale. Stampa gregge di condurre le curve di un ECG da un topo e consapevole dello stesso animale in anestesia inalatoria con sevoflurano. La frequenza cardiaca è calcolato automaticamente dal sistema di telemetria. I 3 secondi sequenza registrata in anestesia indica una frequenza cardiaca di 440 bpm. La curva ha registrato nel topo consapevole mostra una frequenza cardiaca di 660 bpm, che rientra nel range previsto per la frequenza cardiaca durante la modalitàtasso di attività fisiche come il grooming o mangiare. Da biopotenziale / una-lead tracciati ECG, parametri di variabilità della frequenza cardiaca, intervallo Interbeat, e PQ e gli intervalli QT può essere stabilita con l'uso del software del produttore. Figura 4. I dati grezzi da misure a lungo termine in topi sani e malati. Frequenza cardiaca (bpm), la temperatura corporea interna (° C) e l'attività locomotoria (conta) vengono misurate, mentre i topi vengono mantenuti singolarmente nella loro gabbia a casa senza alcun disturbo da procedure uomo o sperimentali. La frequenza cardiaca è registrato per 30 secondi ogni 5 minuti (frequenza di campionamento 1000 Hz). Temperatura corporea viene campionato per 10 secondi ogni 5 minuti. Attività locomotoria è registrata in modo continuo e conservato a intervalli di 5 minuti. Cinque minuti di punti dati sono tracciati per 6,5 giorni. Le misure di telemetria sono registrati da tre topi con differenticondizioni fisiche. Il topo sano mostra un chiaro ritmo circadiano con un aumento nei valori normali fisiologiche e del comportamento durante l'attività locomotoria al buio (notte) di fase. Al contrario, dopo un intervento chirurgico maggiore, la frequenza cardiaca è aumentata, in particolare nella fase di luce del giorno, e l'attività locomotoria è depresso. Il mouse terzo soffriva di malattie croniche del tumore il suo ritmo circadiano della frequenza cardiaca e temperatura corporea appare appiattito, e l'attività locomotoria è diminuita. Dati rappresentante della misurazione della frequenza cardiaca (valori normali e dopo importanti interventi chirurgici) sono tratti dal precedente pubblicazione degli autori 'in Altex 12. Figura 5. Esempio di presentazione dei risultati di misure a lungo termine dopo un esperimento di telemetria. Il dato è tratto dal precedente pubblicazione degli autori 'in animali da laboratorio 1. Come esperimento esemplare, una di 50 minuti isoflanestesia urane o sevoflurano è stata eseguita. L'impatto a lungo termine degli anestetici sulla frequenza cardiaca, temperatura corporea e l'attività locomotoria dopo che gli animali erano svegli è stato confrontato. Utilizzando 16-trasmettitore impiantato nei topi, i dati telemetrici sono stati registrati in otto topi per anestesia, mentre gli animali sono stati sistemati in strutture e ha permesso di muoversi liberamente nelle loro gabbie a casa. Per l'analisi di effetti a lungo termine postanesthetic, abbiamo preso in considerazione che i valori variano molto nel corso di un ciclo di 24 ore da quando i topi sono attivi soprattutto di notte. Pertanto, le medie dei valori di telemetria relativi ad ogni animale sono stati calcolati separatamente per la notte (12 h buio) e giorno (12 h luce) fasi. Valori normali di un individuo sono stati stabiliti calcolando mezzo dai tre giorni precedenti l'anestesia. Per ogni giorno dopo l'anestesia, la media della fase di buio e la luce è stata confrontata con i valori normali della persona, conseguente valori delta. Così, i valori delta rappresentano deviazione dai valori normali (istituito primaper l'anestesia) al corrispondente 12 giorni he di notte. Colonne rappresentano la media di otto topi; barre indicano la deviazione standard. Asterischi indicano significatività P ≤ 0,05 (a senso unico l'analisi della varianza per il confronto delle medie di gruppo in ognuno dei quattro giorni dopo l'anestesia con valori normali).