Implantatie van radiotelemetrie zenders Opbrengst Gegevens over ECG, hartslag, lichaamstemperatuur en activiteit in Free-bewegende laboratoriummuizen

Het dier experiment werd goedgekeurd door de kantonrechter Veterinair Bureau (Zürich, Zwitserland). Huisvesting en experimentele procedures waren in overeenstemming met de Zwitserse wet tot Bescherming van Dieren en voldoen aan de Europese richtlijn betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden (RICHTLIJN 2010/63/EU VAN HET EUROPEES PARLEMENT EN DE RAAD van 22 september 2010). 1. Pre-operatieve overwegingen 1.1 Muizen: woonwensen, algemene conditie en gezondheid bewaking Het wordt aanbevolen dat muizen die geleverd van leveranciers of worden verplaatst van externe knaagdier kolonies moeten komen op de woningmarkt faciliteit ten minste twee weken voorafgaand aan de operatie. Deze periode moet het mogelijk maken de dieren aan te passen aan de nieuwe omgeving en facility-specifieke woonomstandigheden. Muizen, als sociale levende dieren, moeten worden gehuisvest in elkaar passende groepen tijdens deze stage. Voor het monitoren van een individu mate vanvoedsel en water, is elke muis afzonderlijk gehuisvest vanaf 3 dagen voor de operatie tot 10 dagen na de chirurgische zender implantatie. De tijdslijn voor de oprichting van telemetrische-zender-dragende muizen is weergegeven in Figuur 1. Het is cruciaal dat de dieren komen aan de operatie in goede gezondheid en conditie. Daarom, voor de operatie, moeten de dieren een keer worden gecontroleerd per dag gedurende 2-3 dagen met betrekking tot algemene conditie (uiterlijk, houding, spontaan gedrag) als voor het lichaamsgewicht, voedsel en waterverbruik. Deze gegevens worden gedocumenteerd op een medisch dossier (algemene conditie en gezondheid bewaking informatieblad, tabel 1) aan individuele baseline niveau van de algemene conditie en algehele gezondheid en welzijn vast te stellen. Alle dieren die symptomen van de ziekte of een verminderde algemene conditie voor de operatie dient te worden uitgesloten van het experiment. 1.2 Haar knippen op een dag voorafgaand aan de operatie De dagen voorafgaand aan de implantatie, om de anim scherenALS voor een operatie, muizen verdoofd kort in een klein (8x8x8cm) Perspex kamer met behulp van sevofluraan (8%) of isofluraan (5%) in zuivere zuurstof (600 ml / min). Na het verlies van de oprichtreflex reflex, is de muis genomen uit de kamer en de voorste nek en buik haar is geknipt met het dier liggen in dorsale recumbence, anesthesie wordt gedurende ongeveer 5 minuten met een neus masker met sevofluraan 3-4% of isofluraan 1,5-3% in zuivere zuurstof bij een debiet van 600 ml / min. Na het knippen van de haren, worden de dieren toegestaan ​​om wakker te worden en worden dan teruggebracht naar hun kooi. 2. Implantatie 2.1 Operating omgeving, de voorbereiding van de telemetrische zender Op de dag van implantatie, zijn alle procedures met betrekking tot de zender voorbereiding en een operatie uitgevoerd op een werkbank met een laminaire stroming kap voorzien van een chirurgische microscoop. Aseptische omstandigheden worden verzekerd door het gebruik van geautoclaveerd instrumouders en gesteriliseerd materiaal en desinfecteren van de werkbank 7. Voorafgaand aan de implantatie, zijn de telemetrische zenders (ETA-F10, Data Sciences International, St. Paul, MN, USA) eerst bereid. Na het verwijderen van hun steriele verpakking, worden de draden van de zender ingekort tot een lengte geschikt is voor de grootte van de muis te worden geïmplanteerd. In de meerderheid van de volwassen outbred of ingeteelde muizen, kan de rode elektrode worden ingekort tot ongeveer 42 mm en de wit / kleurloos elektrode tot een lengte van ongeveer 55 mm. Isolatie slang is verwijderd uit het distale (zintuiglijke) deel van de kabels: ongeveer 20 mm van de slang is verwijderd uit de rode elektrode, is ongeveer 10 mm van de buizen verwijderd van de wit / kleurloos elektrode. Het distale deel van elke elektrode (die nu is zonder slang) is gevormd in een lus door de vaststelling van het einde met dunne zijde hechtingen (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Duitsland). Na het voorbereiden van de elektroden, is de zender geplaatst in warm steriele zoutoplossing klaar om te worden ingeplant als het dier wordt verdoofd en chirurgisch voorbereid. 2.2 Anesthesie Op 5-10 minuten vóór de inleiding van de inhalatie-anesthesie, een mengsel van midazolam (4 mg / kg) en fentanyl (0,04 mg / kg) worden subcutaan toegediend als premedicatie, en zo sedatie en pre-emptieve analgesie. Algemeen inhalatie-anesthesie wordt geïnduceerd door het plaatsen van het dier in de inductie kamer en de invoering van de vluchtige anestheticum (sevofluraan 8% of 5% isofluraan in zuivere zuurstof 600 ml / min). Als het dier het verlies van de oprichtreflex reflex het is om de werkbank overgedragen onder de laminar flow kap, en geplaatst in dorsale recumbence op een speciaal ontworpen metalen plaat voorzien van een neus masker en slangen uit de narcose apparaat laat zien. Anesthesie wordt onderhouden door de spontane ademhaling (sevofluraan 3-4% of isofluraan 1,5-3% in zuivere zuurstof bij een debiet van 600 ml / min). Tijdens de anesthesie, het dier oogs zijn beschermd met een zalf (vitamine A, Baush & Lomb, Steinhausen, Zwitserland). Liggend op de metalen plaat van het dier wordt opgewarmd door de water-bad verwarmd oppervlak (39 ° C + / -1) van de werkbank. 2.3 Chirurgie De huid van de voorste nek en buikstreek is gedesinfecteerd met 70% ethanol. A 1 – tot 1,5-cm lange incisie in de huid is gemaakt van de lagere thorax langs de middellijn van de buik. De negatieve (wit / kleurloos) lead is subcutaan getunneld van de thorax aan de nek, waar een kleine incisie (≤ 0,5 cm) is gemaakt in de lengterichting. De huid en onderliggende weefsels zijn bereid om ruimte te maken voor de fixatie van de draad lus van de elektrode. De draad lus is bevestigd tussen de spieren aan de rechterkant van de luchtpijp, met behulp van twee dunne zijden hechtingen (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Duitsland). De wond in de hals wordt dan gesloten met resorbeerbare hechtingen (Vicryl 6-0, Ethicon, Norderstedt, Duitsland) in lagen. De buikwand wordt dan geopend op de linea alba en het lichaam van de telemetrische zender is geplaatst in de buikholte van de muis. De draad lus van de positieve (rode) elektrode wordt gehecht aan het zwaardvormig proces met zijden hechtingen op een zodanige wijze, dat het ligt tussen de lever en het diafragma in de linker bovenbuik regio (figuur 2). Vervolgens worden de spieren lagen van de abdominale regio gesloten met resorbeerbare hechtingen (Vicryl 6-0, Ethicon, Norderstedt, Duitsland). Voordat ze uiteindelijk het sluiten van de buikwand, een mengsel van Sulfadoxin en Trimethoprim [(30 mg / kg en 6 mg / kg, respectievelijk; opgelost in 1 ml van een zoutoplossing (0,9%) en ongeveer lichaamstemperatuur (38-39 ° C)] wordt geïnjecteerd in de buikholte in het kader van anti-infectieuze profylaxe en van vocht homeostase te ondersteunen. Ten slotte wordt de huid van de abdominale regio gerestaureerd met nietjes (Precies, 3 M Health Care, St. Paul, MN, USA). 3. Post-operatieve zorg Na voltooiing van chirurgie en anesthesie, 0,1 mg / kg van buprenorfine (Temgesic, Essex Chemie AG, Luzern, Zwitserland) en 5 mg / kg van meloxicam (Metacam, Boehringer Ingelheim, Basel, Zwitserland) wordt subcutaan toegediend voor de pijnbestrijding, en de dieren zijn links op de warme (39 ° C + / -1) oppervlak van de werkbank om te herstellen voor ongeveer 2 uur. Samen met pijnbestrijding (tweemaal per dag: buprenorfine, 0,1 mg / kg en meloxicam 5 mg / kg), is ondersteunende therapie die bestaat uit 300 pi glucose (5%) en 300 pi zoutoplossing (0,9%) opgewarmd tot lichaamstemperatuur, subcutaan tweemaal toegepast per dag gedurende 4 dagen. Voor verder herstel te ondersteunen, is het zinvol het verstrekken van de dieren met een extra drink-fles met 15% glucose-oplossing. Tijdens de herstelperiode van 4-10 dagen, is het aanbevolen dat de dieren worden warm gehouden. Dus in ons geval, zijn de muizen gehuisvest in een opwarming kast (30 ° C + / – 1). Monitoring van de algemene conditie en lichaamsgewicht, alsmaar ook voedsel en water, wordt eenmaal per dag uitgevoerd volgens de algemene conditie en gezondheid bewaking Data Sheet (tabel 1) gedurende 10 dagen post-operatief. Humane eindpunten, dat wil zeggen het offeren van een dier onnodig lijden en pijn te vermijden als de progressie van het herstel onvoldoende is, zijn gerealiseerd onder de volgende voorwaarden: Als in een slechte algemene conditie, dat wil zeggen het dier is aanzienlijk lusteloos (geen beweging na het aanraken / geduwd) en zijn lichaamsoppervlak voelt koud, ondanks de aarde, moet het dier onmiddellijk te worden euthanatized. Indien op dag 4 na de implantatie de zender, het dier duidelijk tekenen van apathie laat zien, is uiterst agressief of laat geen voedselinname, moet deze onmiddellijk worden euthanatized. Op dag 8 na de implantatie de zender, het dier om te laten zien een duidelijke toename van het lichaamsgewicht in vergelijking met het voorgaande postoperatieve dag. Bovendien heeft om te consumeren op lten oosten 80% van de pre-operatieve dagelijkse inname van voedsel. Als een van deze voorwaarden niet is voldaan, moet het dier onmiddellijk te worden euthanatized. Op 10 dagen na de implantatie, is het dier terug naar het dier ruimte onder normale woonomstandigheden. Muizen moeten worden gehuisvest in bij elkaar passende groepen om sociale interactie mogelijk te maken en de nadelige effecten van langdurige individuele huisvesting, die aanzienlijke effecten kunnen hebben op de lees-out van latere experimenten 8, 9 voorkomen. Muizen moeten een periode van ten minste vier weken herstel na de implantatie de zender voor het eerste experiment wordt uitgevoerd en data-acquisitie begint. 4. Data acquisitie Het verzamelen van gegevens is een initiatief van het aanraken van het dier met een magneet, waarna de zender is ingeschakeld. Dataquest ART Software (Data Sciences International, St. Paul, MN, USA) coördineert het opsporen, verzamelen, analyseren en graphical presentatie (in de vorm van een golf vormen) van de signalen van een of meer dieren. De Overname programma verzamelt gegevens signalen naar de computer van de converters en ontvangers via een Data Exchange Matrix (Data Sciences International). Dit programma kan hetzij continu verzamelen van gegevens voor een bepaalde tijd op geregelde tijdstippen of monster en sla de gegevens op de harde schijf van de computer. Als het aanbod en de kwaliteit van het uitgezonden signaal is sterk afhankelijk van de samenstelling van de kooi en de omliggende apparatuur (bijv. metaal vs kunststof), wordt gesuggereerd dat de ontvanger plaat is geplaatst zo dicht mogelijk bij het dier als mogelijk, bijvoorbeeld onder de dieren 'kooi of boven de experimentele gebied, bijv. laboratorium bankje of loopband. Het wordt aanbevolen om de juiste configuratie van de opname en overdracht van gegevens het systeem worden gecontroleerd door het maken van een korte onderzoek van de real-time metingen in de continue bemonstering mode. Nadat de gegevens zijn verzameld en opgeslagen, kunnen ze plotTed, geïnventariseerd en geanalyseerd op een verscheidenheid van verschillende parameters die het gebruik van de Analysis programma. Details van de configuratie van de opname-systeem (bijvoorbeeld het definiëren van de bemonstering modus), en analyse software (bijvoorbeeld voor de hartslagvariabiliteit parameters, PQ interval en QT-interval vastgesteld op basis van biopotential / ECG-curven) is te vinden in handleidingen van de fabrikant. Waardevolle tips voor biometrische planning en statistische methoden nuttig voor telemetrische data-acquisitie en interpretatie zijn elders 3 gepubliceerd. 5. Representatieve resultaten: Een algemene regeling van de beschreven procedure is weergegeven in figuur 1. De positie van de geïmplanteerde zender, inclusief de locatie van de elektroden voor het verkrijgen van biopotentials van het hart (een-lead ECG) is weergegeven in figuur 2. Voorbeelden van ruwe data van korte termijn biopotential bochten (een-lead ECG), en op lange termijn de hartslag, lichaamstemperatuur en bewegingsactiviteit opnames van de individuelemuizen zijn gegeven in figuur 3 en figuur 4, respectievelijk. Figuur 5 geeft een voorbeeld van gepubliceerde gegevens van lange termijn metingen in groepen van muizen na een experiment. Verschillende andere parameters kunnen worden vastgesteld op basis van de biopotentials bochten. Voorbeelden voor de presentatie van de hartslagvariabiliteit parameters 5, QT-interval en PQ-interval 10, zijn 11 elders is gepubliceerd. Tabel 1. Algemene conditie en gezondheid monitoren informatieblad. Klik hier om het blad te downloaden. Dit sjabloon vergemakkelijkt de controle van de algemene een individuele muis conditie en gezondheid. Baseline onderzoek van het uiterlijk van een dier, houding en spontaan gedrag, evenals de bepaling van het lichaamsgewicht, en voedsel en water moet worden vastgesteld vóór de implantatie de operatie een keer per dag gedurende 3 dagen. Vergelijking van de baseline metingen met de verkregen diedaags gedurende 10 dagen na de operatie dienen om de progressie van het postoperatieve herstel te beoordelen. Daarnaast zijn post-operatieve zorg en behandeling van pijn goed gedocumenteerd in de vorm van een medisch dossier. Instructies over humane eindpunten worden gegeven om keuzes te maken over de vraag of een muis moet worden opgeofferd om onnodige pijn en lijden te voorkomen als het dier niet voldoet aan de criteria voor een snel herstel na implantatie. Figuur 1. Schema voor het vaststellen van telemetrische-zender-dragende muizen. Chronologische volgorde van de procedures in verband met de implantatie van een zender met de tijdstippen waarop een muis kan worden gebruikt voor experimenten en data-acquisitie. Figuur 2. Radiografie / schets met de locatie van de geïmplanteerde TelemetRy zender. Het lichaam van de zender is geplaatst in de buikholte. De positieve lood is gevormd in een draad lus en vastgemaakt aan de zwaardvormig proces met hechtingen. De negatieve lood wordt subcutaan tunnel van de thorax om de nek en vaste als een draad lus tussen de spieren direct naast de luchtpijp. De röntgenfoto is afkomstig van de auteurs eerdere publicatie in Laboratory Animals 9. Figuur 3. Biopotential bochten. Raw afdruk van een-lead ECG-curven van een bewuste muis en van hetzelfde dier onder inhalatie-anesthesie met sevofluraan. De hartslag wordt automatisch berekend door het telemetriesysteem. De 3-seconden-sequentie opgenomen onder narcose geeft een hartslag van 440 slagen per minuut. De curve die in de bewuste muizen toont een hartslag van 660 slagen per minuut, die binnen het verwachte bereik valt voor de hartslag tijdens de modetarief fysieke activiteiten, zoals verzorging of eten. Van biopotential / een-lead ECG-curven, hartslag variabiliteit parameters, hartslagen interval, en PQ-en QT-intervallen kan worden vastgesteld met het gebruik van de software van de fabrikant. Figuur 4. Ruwe gegevens van lange termijn metingen in gezonde en zieke muizen. Hartslag (bpm), kerntemperatuur van het lichaam (° C) en de locomotorische activiteit (tellingen) worden gemeten, terwijl muizen zijn individueel gehuisvest in hun eigen kooi, zonder enige verstoring van de mens of experimentele procedures. De hartslag wordt opgenomen gedurende 30 seconden om de 5 minuten (sampling frequentie van 1000 Hz). Kerntemperatuur van het lichaam wordt bemonsterd gedurende 10 seconden om de 5 minuten. Locomotorische activiteit wordt continu geregistreerd en opgeslagen interval van 5 minuten. Vijf minuten datapunten worden getraceerd gedurende 6,5 dagen. De telemetrische metingen worden geregistreerd vanaf drie muizen met verschillendelichamelijke condities. De gezonde muis toont een duidelijk circadiaans ritme met een normale stijging van de fysiologische waarden en locomotorische activiteit gedrag tijdens de donkere (nacht) fase. In tegenstelling, na een grote operatie, is het verhoogde hartslag, in het bijzonder in het daglicht fase, en locomotorische activiteit is depressief. De derde muis leed aan een chronische ziekte tumor-its circadiane ritme van de hartslag en de kerntemperatuur van het lichaam lijkt afgeplat, en de locomotorische activiteit is verminderd. Representatieve gegevens van de hartslag metingen (normale waarden en na een grote operatie) zijn ontleend aan de auteurs eerdere publicatie in Altex 12. Figuur 5. Voorbeeld van een presentatie van de resultaten van lange-termijn telemetrie metingen na een experiment. De figuur is ontleend aan de auteurs eerdere publicatie in Laboratorium Dieren een. Als een voorbeeldige experiment, een 50-minuten isoflurane of sevofluraananesthesie werd uitgevoerd. De lange-termijn effecten van de anesthesie op de hartslag, de lichaamstemperatuur en de locomotorische activiteit na de dieren wakker waren werd vergeleken. Met behulp van 16-transmitter geïmplanteerde muizen, telemetrische gegevens werden opgenomen in acht muizen per verdoving, terwijl de dieren werden enkele gehuisvest en mogen vrij rondlopen in hun eigen kooien. Voor de analyse van lange-termijn effecten postanesthetic, we rekening mee gehouden dat de waarden sterk verschillen tijdens een 24-uurs cyclus is sinds muizen actief zijn vooral 's nachts. Daarom werden de middelen van de telemetrische waarden voor elk dier afzonderlijk berekend voor de nacht (12 uur donker) en de dag (12 uur licht) fasen. Een individu de normale waarden werden vastgesteld door het berekenen van middelen van de drie dagen voorafgaand aan de anesthesie. Voor iedere dag na de anesthesie, was het gemiddelde van de donkere en lichte fase vergeleken met de normale waarden van het individu, wat resulteert in delta waarden. Zo, delta waarden vertegenwoordigen afwijking van de normale waarden (vooraf vastgesteldetot anesthesie) op de overeenkomstige 12 uur dag en nacht de tijd. Kolommen geven het gemiddelde van acht muizen; balken geven de standaardafwijking. Sterretjes geven significantie bij P ≤ 0,05 (One-way variantieanalyse voor vergelijking van de groep betekent in elk van de vier dagen na anesthesie met normale waarden).