Visualização de replicação de DNA no DT40 Vertebrados Modelo de Sistema utilizando a técnica de DNA Fibra

O método descrito aqui foi usado na seguinte publicação: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 cultura de células Materiais: soro fetal bovino (FBS), frango soro, penicilina / estreptomicina, 2-mercaptoetanol, RPMI Prepare meio de cultura celular: FBS adicionar 7%, 3% de soro de frango, 1x penicilina / estreptomicina e 10 mM 2-mercaptoetanol para meio RPMI. DT40 células são cultivadas em frascos de cultura de células estéreis, a 38 ° C e 5% de CO 2 em uma incubadora umidificada. Dividir células todos os dias para uma densidade de 5 x 10 5 células / ml 6. 2. Na rotulagem vivo Materiais: UDI, CldU Preparar soluções estoque de nucleótidos: dissolver UDI a 5 mM e 2,5 mM para CldU no meio. Calor ambas as soluções rapidamente para 60 ° C e vortex até que o análogo dos nucleótidosues são dissolvidos completamente. Adicionar UDI a uma concentração final de 25 mM para crescimento exponencial DT40 células e mistura da suspensão de células também. Incubar as células durante 20 minutos a 38 ° C e 5% CO 2. Após a incubação com a primeira etiqueta, adicione CldU para uma concentração final de 250 mM e tratar células, como descrito no passo anterior. Lavar as células com PBS gelado e ressuspenda-los em uma concentração de 7,5 x 10 5 células / ml em PBS frio. Manter as células rotuladas no gelo. O procedimento de classificação e rotulagem é apenas uma sugestão e pode ser modificado para tratar de questões específicas. Por favor, consulte a seção de discussão para obter mais informações sobre design experimental. 3. Lise celular e DNA se espalhando Materiais: lâminas de vidro, fibra de solução de lise Prepare a solução de lise de fibras: 50 mM EDTA e SDS 0,5% em 200 mM Tris-HCl, pH 7,5 <li> Spot 2 l da suspensão de células para uma extremidade da lâmina de vidro. Secar por 5 minutos ou até que o volume da gota é muito reduzida, mas não seca. Pipeta 7 mL de solução de lise no topo da suspensão de células e agitar suavemente com a ponta da pipeta para misturar as soluções. Incubar por 2 minutos para lise celular para prosseguir. Tilt slides de 15 ° para permitir que as fibras se espalhar ao longo do slide. Uma vez que a solução de fibra atingiu o fundo do slide, colocá-lo horizontalmente para secar ao ar. Após a secagem, uma linha fina, opaca deve ser visível ao longo do slide. Neste ponto, o início das fibras esticadas devem ser marcadas com um lápis como depois da coloração da linha não será visível por mais tempo. Esta marca irá mais tarde ajudar a localizar as fibras sob o microscópio. 4. Imunofluorescência Materiais: metanol, ácido acético, HCl, BSA 5% em PBS, tina de coloração, anti-BrdU anticorpos (mouse),anticorpo anti-BrdU (rato), ovinos anti-rato Cy3 de anticorpos, de cabra anti-rato Alexa Fluor 488 anticorpos, Vectashield meio de montagem, lamínulas, unha polonês Imergir as lâminas em metanol / ácido acético (3:1) em uma tina de coloração e incubar por 10 minutos. Lavagem das lâminas em água destilada H 2 O, em seguida, mergulhar em 2,5 M HCl por 80 minutos. Lavagem das lâminas três vezes em PBS por 5 minutos. Retirar as lâminas da tina de coloração e recolher PBS excesso com uma toalha de papel. Colocar as lâminas na horizontal e BSA pipeta de 5% em cima de cada slide. Cobrir os slides suavemente com uma lamela para espalhar a BSA uniformemente sobre a lâmina e incubar por 20 minutos. Diluir os anticorpos primários em BSA 5% nas seguintes concentrações: 1:25 anti-BrdU (mouse) e 1:400 anti-BrdU (rato). Mover a lamela suavemente a lâmina de vidro para removê-lo. Não force se a lamínula adere ao slide. O slide pode ser reidratados em PBS até a lamela fica solto umd pode ser removido com facilidade. Coletar BSA excesso com uma toalha de papel e coloque os slides na horizontal. Pipete 50 da solução de anticorpo primário em cada slide. Cubra novamente com uma lamela para espalhar a solução de anticorpos uniformemente sobre a lâmina e incubar em câmara úmida por 2 horas. Depois de retirar as lamelas, lavar as lâminas três vezes em PBS por 5 minutos Diluir os anticorpos secundários em BSA 5% nas seguintes concentrações: 1:500 ovelhas anti-rato Cy3 e 1:400 de cabra anti-rato Alexa Fluor 488. Aplicar 50 ul da solução de anticorpo secundário como descrito para os anticorpos primários. Proteger os slides da luz e incubar por 1 hora. Depois de retirar as lamelas, lavar as lâminas três vezes em PBS por 5 minutos. Adicionar uma gota de Vectashield meio de montagem em cada slide e uma lamela. Pressione suavemente as lamelas e remover o excesso de fluido em torno dele com uma toalha de papel. Lamínulas selo com unhas transparente polish e deixe-os secar. Armazenar os slides a -20 ° C. 5. Aquisição de imagem Materiais: microscópio de fluorescência da câmera, Coloque uma gota de óleo de imersão em uma corrediça de perto da marca de lápis e começar a localizar as fibras. Normalmente, há um feixe de fibras principais, mas essas fibras são muito preso e não pode ser analisada mais tarde. Afastar-se do feixe principal para encontrar áreas onde as fibras são claramente separados uns dos outros (Fig. 2). Gostaríamos de selecionar fotos usando apenas um canal de cor a fim de evitar viés. Então, levaria cerca de 10 fotos de cada linha de concentração ponto, ou de células da hora. No entanto, o número de imagens depende de quantas fibras podem ser contadas em cada imagem. Se movem ao longo do slide para tirar as fotos diferentes, como uma área de um slide pode não fornecer comprimentos de fibra representante ou estruturas de replicação. 6. A análise dos dados <p class="Jove_content"> Materiais: programa de análise de imagem, por exemplo, ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) Importar imagens em um programa de análise de imagem. Medir o comprimento dos feixes de fibras e / ou contar as estruturas de replicação diferentes (Fig. 3). Só contam as fibras que são claramente visíveis e que não se estendem ao longo da borda da imagem. Normalmente, medir o comprimento de cerca de 100 fibras e contagem de 150-200 estruturas de replicação e gostaríamos de repetir experiências individuais, pelo menos, três vezes. 7. Resultados representativos: DNA recém-replicada pode ser visualizado como linhas de anticorpo marcado com nucleótidos. Em nossos experimentos um garfo em curso é representado como adjacentes sinais vermelho e verde (Fig. 3). O protocolo a dupla marcação também nos permite definir quatro classes principais de estruturas de replicação: 1) eventos de iniciação novo pode ser divid ed em origens que dispararam enquanto as células foram incubadas com o rótulo de primeiro e origens que dispararam durante a incubação com o rótulo de segundo. O primeiro consiste de vizinhos verde-vermelho-verde e os últimos sinais de uma linha verde só. 2) manifestar-se como eventos de rescisão adjacentes vermelho-verde-vermelho sinais. 3) intercaladas origens são os locais no genoma com origens espaçados. Esses sites consistem de origens consecutivos e sinais de terminação. 4) dependendo do projeto experimental, parado / garfos colapso pode ser definido como um sinal vermelho apenas 7 ou uma linha vermelha seguido de um intervalo curto verde 8,9. Usando as condições aqui descritas, as células do tipo selvagem DT40 têm uma velocidade de garfo média de 0,4 mM / min. Podemos detectar aproximadamente 63% garfos em curso, a origem de 10%, 16% garfos parado (vermelho folhetos apenas), terminações 8% e 3% de fibras intercaladas. ure 1 "/> . Figura 1 (A) O lado esquerdo do desenho animado retrata o primeiro passo do processo de rotulagem DNA: a adição de UDI para crescimento exponencial DT40 células leva o análogo de nucleotídeo para ser facilmente incorporados ao líder recém-sintetizado e atraso fitas de DNA. Isto pode ser visualizado utilizando um anticorpo específico, e será exibido como uma linha vermelha quando visto sob o microscópio. Posteriormente, o mesmo procedimento é repetido com CldU como mostrado no lado direito da figura. Após a incubação com o análogo de nucleotídeo segundo, um garfo de ativos será visível como um trato vermelho-verde adjacente. O comprimento médio de fibra é proporcional ao tempo de incubação da nucleótidos. (B) o DNA de células lisadas DT40 é esticada por gravidade para uma lâmina de microscópio e os análogos de nucleotídeos incorporados são visualizados através da utilização de anticorpos específicos e de microscopia de fluorescência. IGURA 2 "/> Figura 2. A imagem representativa mostra de fluorescência de fibras de tipo selvagem DT40 células posteriormente rotulados com UDI e CldU por 20 minutos cada. A maioria das fibras são bem separadas umas das outras e podem, portanto, ser facilmente analisado. A barra branca representa 10 mM. . Figura 3 A técnica de fibra rotulagem dupla permite distinguir entre as estruturas de replicação diferentes; 1 – garfos ativamente replicar, 2 – novos locais de replicação do DNA (disparo de novas origens), 3 – terminações fork (dois garfos convergentes), 4 – fibras intercaladas (sites de origens espaçados) e 5 – garfos parado (único sinal vermelho).