DT40, un sistema modello vertebrato genetico, fornisce un potente strumento per analizzare la funzione delle proteine. Qui si descrive un metodo semplice che permette l'analisi qualitativa dei parametri che influenzano la sintesi del DNA durante la fase S in DT40 cellule a livello di singola molecola.
Mantenimento della stabilità replica forcella è della massima importanza per la divisione delle cellule per preservare la vitalità e prevenire le malattie. I processi coinvolti non solo garantire la duplicazione del genoma fedeli di fronte a danni al DNA endogeno ed esogeno, ma anche prevenire l'instabilità genomica, un fattore riconosciuto causale nello sviluppo del tumore.
Qui, descriviamo un microscopio a base semplice e conveniente fluorescenza metodo per visualizzare la replicazione del DNA nelle cellule B aviaria linea DT40. Questa linea cellulare fornisce un potente strumento per studiare la funzione delle proteine in vivo dalla genetica inversa nelle cellule dei vertebrati 1. Fibra Fluorografia DNA in cellule DT40 manca un gene specifico permette di chiarire la funzione di questo prodotto del gene nella replicazione del DNA e la stabilità del genoma. I metodi tradizionali per analizzare le dinamiche forcella di replicazione nelle cellule dei vertebrati si basano sulla misurazione del tasso globale di sintesi del DNA in una popolazione di cellule etichettate impulsi. Si tratta di un approccio quantitativo e non consente per l'analisi qualitativa dei parametri che influenzano la sintesi del DNA. Al contrario, il tasso di circolazione delle forche attivo può essere seguito direttamente quando si utilizza la tecnica del DNA in fibra di 2-4. In questo approccio, il DNA nascente è etichettato in vivo per incorporazione di nucleotidi alogenati (Fig. 1A). Successivamente, le singole fibre sono allungati su un vetrino da microscopio, e con l'etichetta tratti di replicazione del DNA sono colorate con anticorpi specifici e visualizzati al microscopio a fluorescenza (Fig. 1B). Avvio di replica e direzionalità forcella è determinato mediante l'uso consecutivo di due analoghi diversamente modificati. Inoltre, la doppia etichettatura approccio permette di analisi quantitativa di parametri che influenzano la sintesi del DNA durante la fase S, ovvero la replica di strutture quali le forcelle in corso e in fase di stallo, l'origine densità replica così come terminazioni forchetta. Infine, la procedura sperimentale può essere realizzareed in un giorno, e richiede solo attrezzature generali di laboratorio e un microscopio a fluorescenza.
Descriviamo un metodo che permette di analisi quantitativa di parametri che influenzano la sintesi del DNA durante la fase S a livello di singola molecola. Negli ultimi dieci anni, diverse versioni della tecnica del DNA Fluorografia fibra sono stati sviluppati per visualizzare il movimento delle forche replica singoli all'interno delle cellule viventi. Il parametro fondamentale in tutte queste tecniche è la procedura utilizzata per ottenere la migliore possibile allungamento del DNA sulle superfici di vetro che fornisce ben separate le fibre del DNA. Un passo fondamentale per raggiungere questo obiettivo è il tempo di incubazione della sospensione cellulare sul vetrino da microscopio così come il tempo lisi. Questi parametri dipendono dalla temperatura e flusso d'aria in un laboratorio di particolare e dovrebbe essere empiricamente determinato. La parte pratica di un esperimento in fibra di DNA in genere viene eseguita entro un giorno. Tuttavia, l'acquisizione dell'immagine e successive analisi è più tempo e richiede pratica.
Il protocollo di etichettatura può essere annuncioApted per rispondere a vari problemi scientifici: con un agente che interferisce con la replica durante l'etichettatura secondo impulso monitor allungamento forcella / stallo in risposta allo stress replicativo. In questo scenario, la prima etichetta non ha bisogno di essere lavati come il nucleotide è aggiunto il secondo in eccesso. In alternativa, i farmaci che impediscono la replicazione può essere usato in combinazione o appena dopo l'aggiunta della prima etichetta. Ciò richiede la prima etichetta e il farmaco deve essere rimosso prima l'analogo secondo nucleotide è applicata. Questa procedura permette di determinare l'importanza di diversi fattori di riparazione del DNA sulla stabilità replicativa forcella / recupero in condizioni di stress replicativo (forcella cioè stallo e / o collasso). Degno di nota, un'analisi più dettagliata dei particolari del programma di replicazione del DNA potesse essere eseguita con l'uso di un approccio alternativo che combina DNA e la pettinatura ibridazione in situ fluorescente. Questo però, è tecnicamente più impegnativo e richiede speseattrezzature SIVE.
La capacità di analizzare qualitativamente e quantitativamente le indicazioni della replicazione del DNA offre uno strumento essenziale per studiare i difetti nella replicazione del DNA stesso, come pure i percorsi che sopprimono l'instabilità genomica associata con forche di replica. Indubbiamente, questo saggio sarà ulteriormente aiutare a far luce sui meccanismi di replicazione mediata riparazione del DNA che permettono alle cellule normali di rispondere / adattarsi ai cambiamenti ambientali e come le cellule tumorali utilizzano questi meccanismi per resistere alla tossicità dei farmaci destinati forche replica.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il dottor T. Helleday e Dott. E. Petermann per aiutare con la tecnica della fibra così come i membri del laboratorio di discussione utile. WN è supportata da un Senior Fellowship Research International presso l'Associazione per la Ricerca sul Cancro Internazionale e dal Comitato di Stato polacco per la ricerca scientifica di sovvenzione (N301 165935).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA | A15-151 | |
Chicken serum | Sigma | C5405 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
5-Iodo-2′-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
5-Chloro-2′-deoxy-uridine (CldU) | Sigma | C6891 | |
Microscope slides SuperFrost | VWR | 631-0910 | |
Cover slips No1 | Scientific lab suppplies | MIC3234 | |
Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
sheep anti-mouse Cy3 | Sigma | C2181 | |
goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 | |