刀口扫描显微镜的样品制备，图像和分析协议

1。试样准备：高尔基 – 考克斯紧随该协议的协议。Mayerich等7。 的C57BL/6J小鼠深深麻醉用异氟醚吸入麻醉，然后断头。 大脑中删除，并放入一个高尔基考克斯固定的解决方案（1％铬酸钾，1％重铬酸钾，去离子水和1％的升汞）。 大脑是留在黑暗中的高尔基体考克斯解决方案，在室温，10至16周。 大脑在黑暗中过夜去离子水冲洗。 沉浸在铵去离子水在室温下，在黑暗中为7至10天5％的氢氧化钠溶液冲洗大脑。这个漫长的准备时间，以确保整个大脑的渗透，使黑色沉淀物有机会在组织完全形成。 大脑是在去离子水冲洗干净，再在室温为4小时和T母鸡通过乙基醇梯度脱水：50％和70％的冰箱（4℃），和85％，95％（3变化），和100％（4至5变化）在室温下。大脑是留在每24小时的解决方案。 然后把脱水的大脑是在丙酮（3至4的变化，每一天），牢牢丙酮比为1:2，1:1，2:1，终于在丙酮100％的牢（3变化，每次通宵），在冰箱中，（4℃ ）。 最后，处理后的大脑是嵌入在100％牢，并加热至60 ° C，连续3天（参见2雅培和Sotelo嵌入协议）。 如果标本在LR白嵌入式然后通过三个转变LR白色的解决方案，均在冰箱过夜，这是一个标准程序聚合前的标本是从过去的100％的乙醇溶液转移。完成三个转变，以确保充分浸润。标本是T母鸡转移到新鲜LR的白色聚合在一个密闭容器中，在60 ° C为24小时，这是正确的聚合所需的时间和温度。 图图1显示了高尔基体考克斯染色脑嵌入在环氧树脂。 固化后的试样块，然后安装在金属试样用环氧环，块的两侧，作为必要的修剪（见图2）。 2。试样制备：尼斯尔鼠标是深深使用氯胺酮和甲苯噻嗪（1.7毫克氯胺酮/甲苯​​噻嗪0.26毫克每20克体重）腹腔注射麻醉，然后用50毫升室温灌注transcardially磷酸盐缓冲液（pH值7.4），250毫升的空间温度10％的中性福尔马林缓冲液（pH值7.4）。最后用3.0毫升未经稀释的印度墨水。 全身灌注生理盐水和固定液是必要的，以清除血液和心血管系统的修复的TI ssues。印度墨汁灌注是必要的，完全填补了心血管系统的血管。 通过一系列分级乙基醇（25％-100％）造成的大脑，然后脱水，然后在牢塑料嵌入在1.8-1.9以上的协议。如果LR白了就是包埋剂，然后在1.10以上的协议是其次。 4。试样制备：通用品种，一般机关一般情况下，可以用固定为10％中性缓冲福尔马林或4％多聚甲醛。 对于小型组织卷，而不是灌注扩散，建议固定和染色。在小生物体或器官的情况下，染色也可以做到在脱水过程中。 嵌入协议是与上面相同，解决方案渗透的时代，虽然可以减少器官或生物体，比整个鼠脑小。 jove_title“> 5。KESM设置和成像关闭泵，打开舞台上，打开相机，打开照明灯。 提高刀和客观。 安装试样环。 测量试样的尺寸和KESM阶段Controller2应用程序创建一个配置文件。 开始KESM阶段Controller2和初始化阶段。 下刀/目标，打开泵。 焦点目标和摄像头，眼镜直通车转动调焦旋钮，调整摄像机的视野相对刀刃。 按[返回]发起成像。 参见图。 3-8。见9的技术细节，7。 6。图像处理和数据准备 KESM栈处理器可执行文件复制到数据文件夹下的配置文件的文件夹（00000，00001等）。 KESM栈处理器运行删除照明神器和正常化的背景强度图像。重复子文件夹中的所有数据。 准备从数据多尺度瓷砖设置和KESM脑Atlas的Web服务器中的文件上传，并成立。 见图。 9。 7。数据可视化和分析使用KESM脑图谱的可视化。转到http://kesm.cs.tamu.edu ，并选择适当的地图集。 在谷歌地图导航。 在谷歌地图的放大和缩小。 要进入到一个不同的深度，选择从下拉菜单中的每一步有多深，然后点击或者[+]或[ – ]增加或减少Z深度。 通过使用下拉菜单调整叠加数量。 通过使用下拉菜单调整覆盖的时间间隔。 见图。 11。 可视化使用MeVisLab。 启动MeVisLab。 创建一个新项目。 在下面的，新的模块，可以创建由Ty平安在命令中的模块名称。 创建模块[Compose3Dfrom2DFiles]，并转到所需的文件夹。输入文件中的字符串，然后单击[GetFileList]。确保选定的图像可以容纳在内存。点击[Create3D]创建卷。 创建模块[SetWorldMatrix]，并设置下的“刻度”“初等变换”X，Y，Z适当的体素大小（0.6，0.7，1.0 10X 0.45NA目标）。链接[Compose3Dfrom2DFiles]至[SetWorldMatrix]。 集矩阵和变换“基质组成”下“忽略”，“忽略”，“前进”。 创建模块[Arithmetic1]，并设置“功能”，“反转（最大图）”。 链接[SetWorldMatrix]至[Arithmetic1]。 [View3D创建模块和连接[Arithmetic1]。 View3D，同时按下鼠标右键，移动鼠标左右调整门槛。您可以裁剪区域，改变方向（移动鼠标的同时按下鼠标左键），改变照明（体积rendering或MIP），开启/关闭背景等。 见图。 10。 8。代表性的成果： 在这里，我们目前全脑的数据和细节。图。 12-15显示全脑墨汁，高尔基，和尼氏数据集1，4，3。 图1固定，染色和嵌入式的小鼠大脑 。 图2嵌入式鼠脑标本安装在试样环。 图3。刀刃扫描显微镜（KESM）。 KESM的照片显示标明其主要成分：（1）高速线扫描相机，（2）显微镜的物镜，（3）钻石刀大会和光准直器，（4）SPEcimen罐（水浸泡成像），（5）三轴高精度空气轴承阶段，（6）白光显微镜照明，（7）水泵去除切片组织（回），（8） PC服务器阶段控制和图像采集，（9）花岗岩基座，和（10）花岗岩桥。 图4。KESM的成像原理。 KESM操作主要是说明。目标和刀在地方举行，而标本的定位阶段动作（实线箭头），在分辨率为20 nm和旅行速度的1-5贴，并获得对钻石刀刮掉（5毫米宽10X的目标），生成一个薄片，流经刀（实线箭头）。行扫描成像是附近的刀很尖。 图5KESM相机和目标的重点控制。 图6。KESM刀大会和控制。 图7。初步通过观察口为重点。 图8。KESM级控制器应用程序（截图）。 图9。KESM栈处理器的应用程序（截图）。 图10。MeVisLab应用程序（截图）。 <br/> 图11。KESM大脑图谱：Web界面（截图）。 图12。KESM全脑墨汁数据。 KESM数据栈卷可视化显示血管的数据集。 （ 一 ）特写血管的数据。宽度〜100 UM。 （BD）三个标准的意见，整个鼠脑血管（高分辨率数据的子采样）。宽度〜10mm的。 图13。KESM全脑鼠标高尔基数据。 图14。KESM高尔基数据的详细信息。 图15。KESM全脑尼氏数据。 （ 一 ）特写了NISSL数据。 〜300 UM 3。 （BD）三个标准的意见，整个鼠脑尼氏数据（高分辨率数据的子采样）。横截面所示的内部结构的一个明确的说法。