Protocolli Preparazione del campione, Imaging, e d'analisi per Knife-edge Microscopia Scansione
Summary
L'intero processo, dalla preparazione del campione di cervello di serie di immagini utilizzando il sezionamento Knife-Edge microscopio a scansione, alla visualizzazione dei dati e l'analisi è descritta. Questa tecnica è attualmente utilizzata per acquisire dati cervello di topo, ma è applicabile ad altri organi, altre specie.
Abstract
Importanti progressi nella high-throughput ad alta risoluzione, tecniche di microscopia 3D hanno permesso l'acquisizione di grandi volumi di dati neuroanatomici a risoluzione submicrometer. Uno dei primi strumenti quali la produzione di tutto il cervello scala dei dati è il Knife-Edge microscopio a scansione (KESM) 7, 5, 9, sviluppato e ospitato nel laboratorio degli autori '. KESM è stato utilizzato per sezione e cervelli del mouse intera immagine a una risoluzione submicrometer, rivelando gli intricati dettagli delle reti neuronali (Golgi) 1, 4, 8, reti vascolari (inchiostro di china) 1, 4, e il corpo di distribuzione delle cellule (Nissl) 3 . L'uso di KESM non è limitato al mouse né il cervello. Abbiamo ripreso con successo il cervello polpo 6, polmone del mouse e cervello di ratto. Attualmente stiamo lavorando su tutto embrioni di pesce zebra. Dati come questi possono contribuire ampiamente a connectomics ricerca 10; per la microcircolazione e la ricerca emodinamica, e alla ricerca stereologia da disposizioniding un esatto terra-verità.
In questo articolo descriveremo il gasdotto, compresa la preparazione del campione (fissaggio, colorazione, and Embedding), la configurazione e setup KESM, sezionamento e di imaging con la KESM, elaborazione delle immagini, la preparazione dei dati e visualizzazione dei dati e analisi. L'accento sarà posto sulla preparazione dei campioni e la visualizzazione / analisi dei dati KESM ottenuti. Ci aspettiamo che il protocollo dettagliato presentato in questo articolo per contribuire ad ampliare l'accesso alle KESM e aumentare il suo utilizzo.
Protocol
Discussion
Il KESM consente una submicrometer livello sondaggio di grandi volumi di campione biologico (~ 1 cm 3). Questo tipo di volume è sufficiente a contenere interi organi per piccoli animali, come cervello, polmoni, cuori, reni, ecc acquisite le immagini da tali organi senza precedenti in grado di fornire informazioni quantitative circa l'organizzazione strutturale di questi organi, e consentire la modellazione computazionale funzionale di varie aspetti di questi organi, compreso le dinamiche di circuito e di rete, proprietà elettriche, dei fluidi e la dinamica del flusso d'aria, e la dinamica muscolare.
Il protocollo di preparazione dei campioni e post-analisi protocollo dettagliato in questo articolo sono attesi per aiutare i gruppi di ricerca esterni per avere un più facile accesso al KESM nonché i dati risultanti. Il protocollo operazione KESM aiuterà questi ricercatori esterni per apprezzare i vantaggi ei limiti di questa modalità di imaging unico.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato dal NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), NSF (# 0905041, # 0079874), la tecnologia Texas Advanced Program (# ATP-000512-0146-2001, # ATP-000512-0261-2001), Texas A & M Fondazione per la Ricerca, Dipartimento di Informatica e Ingegneria presso la Texas A & M University, e 3Scan. Vorremmo ringraziare Bernard Mesa (Micro Technologies stella) per consulenza tecnica e supporto per la strumentazione KESM. Parti più importanti della progettazione e realizzazione del KESM è stato fatto da Bruce H. McCormick, morto nel 2007.
Referências
- Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 504.2, (2008).
- Abbott, L. C., Sotelo, C. Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices. Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).
- Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -. F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 516.3, (2010).
- Choe, Y., Han, D., Huang, P. -. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, (2009).
- Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H., Ravi Rao, A., Cecchi, G. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications. , 11-37 (2008).
- Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope. BMC Neuroscience. 11, 136-136 (2010).
- Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).
- Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM. Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).
- McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , (2002).
- Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).
