تحضير العينة ، والتصوير ، وتحليل بروتوكولات لالميكروسكوب الضوئي سكين الحافة
Summary
وصفت عملية التحضير الكامل من عينة المخ لتصوير المسلسل sectioning باستخدام مجهر المسح حد السكين ، لتصور وتحليل البيانات. ويجري حاليا استخدام هذه التقنية للحصول على بيانات مخ الفأر ، ولكنه ينطبق على الأجهزة الأخرى ، وأنواع أخرى.
Abstract
وقد مكنت الاكتشافات الكبيرة في الإنتاجية العالية ، وارتفاع القرار ، وتقنيات الفحص المجهري 3D اقتناء كميات كبيرة من البيانات في القرار submicrometer تشريحي عصبي. واحد من الصكوك الأولى من نوعها تنتج في الدماغ كله على نطاق البيانات هي مجهر مسح السكين الحافة (KESM) 7 ، 5 ، 9 ، المتقدمة واستضافت في مختبر المؤلفين. وقد استخدمت KESM إلى الباب والعقول كلها في صورة الفأر submicrometer القرار ، وكشف عن التفاصيل المعقدة للشبكات العصبية (غولجي) 1 ، 4 ، 8 ، وشبكات الأوعية الدموية (الهند الحبر) 1 و 4 و الخلية توزيع الجسم (نيسل) 3 . ولا يقتصر استخدام الفأرة لKESM ولا الدماغ. لقد نجحنا في تصوير الدماغ الأخطبوط 6 ، الرئة الماوس ، والدماغ الفئران. نحن نعمل حاليا على كامل أجنة أسماك الزرد. ويمكن مثل هذه البيانات تسهم إسهاما كبيرا في البحوث connectomics 10 ؛ لدوران الأوعية الدقيقة والبحوث الدورة الدموية ، والتجسيم للبحث عن طريق ال Øقرع ملف. الدقيق الأرضية الحقيقة
في هذه المقالة ، فإننا سوف تصف خط الأنابيب ، بما في ذلك إعداد العينات (إصلاح ، وتلطيخ ، وتضمينها) ، KESM التكوين والإعداد ، والتصوير sectioning مع KESM ، ومعالجة الصور ، وإعداد البيانات ، والبيانات والتصور والتحليل. وسوف يكون التركيز على إعداد العينات والتصور / تحليل البيانات التي تم الحصول عليها KESM. نتوقع بروتوكول المفصلة التي قدمت في هذه المقالة للمساعدة في توسيع فرص الحصول على KESM وزيادة الاستفادة منه.
Protocol
Discussion
وKESM يسمح لمسح submicrometer المستوى من كميات كبيرة من العينات البيولوجية (~ 1 سم 3). اخذت الخ هذا النوع من حجم كاف لعقد كامل الأجهزة الحيوانات الصغيرة ، مثل العقل والرئتين والقلب والكلى ، وصور من هذه الأجهزة يمكن أن توفر معلومات كمية لم يسبق لها مثيل حول التنظيم الهيكلي لهذه الأجهزة ، وتمكن من النمذجة الحاسوبية الفنية المختلفة جوانب من هذه الأجهزة ، بما في ذلك ديناميات الدوائر والشبكة ، والخصائص الكهربائية ، وديناميات السوائل وتدفق الهواء ، وديناميكية العضلات.
ومن المتوقع أن بروتوكول إعداد العينات وبروتوكول ما بعد تحليل مفصل في هذه المقالة لمساعدة المجموعات البحثية خارج لسهولة الوصول إلى KESM والبيانات الناتجة عن ذلك. فإن بروتوكول العملية KESM مساعدة هؤلاء الباحثين الخارجيين لتقدير الفوائد والقيود المفروضة على هذه الطريقة تصوير فريدة من نوعها.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NINDS (# 1R01 – NS54252) ، جبهة الخلاص الوطني (# 0905041 ، 0079874 #) ، وبرنامج التكنولوجيا المتقدمة في تكساس (ATP – # 000512-0146 – 2001 ، # ATP – 000512 – 0261 – 2001) ، تكساس A & M مؤسسة أبحاث ، قسم علوم الكمبيوتر والهندسة في جامعة تكساس A & M ، و3Scan. نود أن نشكر برنار ميسا (مايكرو ستار تكنولوجيز) للتشاور والدعم الفني لأجهزة KESM. وقد تم أجزاء كبيرة من تصميم وتنفيذ KESM بواسطة بروس ماك كورميك ، الذي توفي في عام 2007.
Referências
- Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 504.2, (2008).
- Abbott, L. C., Sotelo, C. Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices. Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).
- Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -. F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 516.3, (2010).
- Choe, Y., Han, D., Huang, P. -. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, (2009).
- Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H., Ravi Rao, A., Cecchi, G. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications. , 11-37 (2008).
- Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope. BMC Neuroscience. 11, 136-136 (2010).
- Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).
- Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM. Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).
- McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , (2002).
- Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).
