1。人类宿主细胞和细菌培养文化脐静脉内皮细胞之间的通道1和5％（V / V）的CO 2培养箱在37 ° 9。通道的细胞，他们的做法与胰蛋白酶/ EDTA 80％汇合时提供75厘米的培养瓶和一次性流室（μ-幻灯片六）实验文化维护文化。 退出要传代培养瓶的培养基，用10毫升的PBS洗细胞，撤回和更换1.5毫升的胰蛋白酶/ EDTA。允许细胞在细胞培养孵化器分离5分钟在37 ° C。 收集细胞培养液10毫升到15毫升收集管的细胞。一个5分钟的离心沉淀细胞（200克），在室温下。暂停4毫升内SFM辅以10％的细胞（V / V）FBS和计数上Malassez腔，根据制造商的指示。 引入通道（3X10共4个 ）30一个1 × 10 6 HUVEC细胞每毫升悬浮液，并允许坚持3个小时的细胞在培养箱在37 ° 5％（V / V）的CO 2的气氛。添加一个额外体积为120μL内SFM填补了井。细胞应形成subconfluent的单层（图2）。 成长N。脑膜炎表达GCB琼脂含有凯洛格的补充和5在37微克/毫升的氯霉素°在一个潮湿的含有5％的气氛彗星（V /板绿色荧光蛋白（在这种情况下的应变8013表达一个IPTG的诱导启动子控制下的GFP）， V）CO 2为16小时。 2。个别细菌的初始粘附到宿主细胞调整预热远藤- SFM包含120分钟的10％（V / V）FBS和孵化在37 °在潮湿的大气中含有5％（V /彗星OD600值0.05 GCB琼脂平板上生长的细菌含量V）CO 2，下轻轻摇动（130转）。整个孵化期的培养基中加入1 mM的IPTG的诱导GFP的表达。 放在倒置显微镜配备了激烈的平台，样品的温度保持在37 ° C。阶段一次性μ- SLIDE 无菌玻璃烧杯倒入预热远藤- SFM辅以2％（V / V）胎牛血清和填充50毫升无菌注射器，这种媒介。将“进入”管注射器和填写引入介质。 连接“入口”的μ- SLIDE油管，小心，以避免空气进入墓室。然后，贴上“退出”管的另一端，并认真填写渠道中“退出”室约1厘米的距离。 测量细菌的OD600值和内SFM含有2％（V / V）FBS的调整到0.15。为了寻找个别细菌必须被打乱，任何聚集的细菌样本的蓬勃震荡。 广场100μL内SFM进了水库，并辅以2％（V / V）FBS的培养基，添加100μL细菌的解决方案采取的振荡的解决方案，以避免采样任何剩余的细菌总量的顶部。 小心地转动活塞腔注入细菌引入到μ-幻灯片200μL体积。 引进内SFM含2％（V / V）FBS的，保持在37 °加热平台，进入会议厅使用注射泵剪应力兼容0.044达因/厘米2 15分钟的附着力。 例如，请参阅视频1或图3。这一步后，可以移动到第3，4或6。 3。个别细菌的初始粘附宿主细胞的定量经过15分钟的初始粘附，十个领域获得的图像随机，而液体至今仍流传。 分析获得的图像，使用ImageJ 软件 8，以访问adherant细菌每场平均人数。这样做如下：首先，每个图像使用的“门槛”窗口，在“图像”菜单中找到，同时最大限度地从细胞中的背景，以突出个人坚持的荧光细菌阈值。然后，每一个单一的细菌也计算在内，通过使用插件“细胞计数” （ http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html） 。每幅图像的数据报告在Excel电子表格，并平均量化附着细菌每场平均人数。 4。测量电阻，个别细菌附着在宿主细胞流计划注射泵设置产生剪应力，从3到100达因/ 厘米 2 5分钟。 在5分钟结束时，获得随机选择步骤3.1中所述的10个领域，但与流动停止PRIOR到收购。 步骤3.2中所述的分析获得的图像和量化平均每场剩余的细菌数量。 5。测量一个孤立的附着细菌的生长到microcolony 引进内SFM含10％（V / V）胎牛血清，保持在37 ° C，加热平台进入会议厅使用注射泵与所选择的几个小时的剪应力。为每5分钟一帧的实时视频显微镜图像记录。 下面的视频显微镜，停止关闭注射泵的剪应力，获得2-3额外的图像，然后停止该软件的图像采集序列。细菌繁殖的一个例子可以看出，在视频2。 6。测量电阻附着细菌microcolonies的流动 （step5.2）收购后的细胞表面形成大microcolonies流应用程序的前2-3图像的两种细胞（相位相反）和细菌（GFP荧光）。其余实验，收购协议将只监视的荧光。 高剪切力，在每5秒一帧为5分钟（3-100达因/ 厘米 2），并记录图像中的应用。 停止关闭注射泵的剪应力，获得2-3额外的图像，然后停止对软件的图像采集序列。 接下来，删除第一个“退出”管，仔细，避免排空的通道，然后添加新鲜培养基预热，以填补之前删除“进入”管的井。 为了定量确定的剪应力的作用，对细菌耐药性，可进行电镀实验如下：收集剩余的介质，并用120μL的PBS，删除剩余的介质通道（都洗两次的μ- SLIDE还收集了）。 分离感染的细胞在37℃5分钟与50μL胰蛋白酶/ EDTA此外，在上一步所收集的暂停和混合分离样品。 执行连续稀释在PBS和板10μL分数到GCB琼脂平板上，一式三份，以确定第二天的菌落形成单位（CFU）的板孵化后，在37 ° C的孵化器5％（V / V）的CO 2。 影片3和4比较淠绿突变体与野生型菌株。 7。细菌支队从microcolonies 感染细胞在流动腔重复步骤2.1至2.8，并允许进行30分钟的感染。 一段2分钟的流量增加至10达因/ 厘米 2，删除未绑定的细菌，使感染继续为2h。 减少流量0.15达因/厘米2。 每隔一小时，收集流室，中型下降。 执行系列稀释样品和GCB琼脂平板上板他们。 确定第二天的菌落形成单位（CFU）的，板块的孵化后在37℃的孵化器C的5％（V / V）的CO 2 。 8。代表性的成果 图1：在流动过程中的存在，可以观察和测量的一个细胞单层的不同步骤。 图2：在实验（剪应力的情况下）开始在流动腔的内皮细胞单层。约50内皮细胞组织在子汇合单层。 图3：初步粘附细菌的细胞表面上的图形表示。三个字段的值是表示磁场对磁场的变化，预计（0044达因/ 厘米 2）的想法。 视频1。初始的细菌粘附细胞单层作为时间的函数（0044达因/厘米2）可视化。表达GFP的细菌以下的流动介质的方向。这部电影是加快了60倍，真正的视频持续时间为10分钟。 点击这里观看视频。 视频2，经过初步粘附的细菌。被允许细胞表面上的增殖期为7小时（加速1000倍）。 点击这里观看视频。 视频3。细胞表面上的机械师，后扩散剪应力水平增加5分钟，但野生型microcolonies耐加速60倍到10达因/厘米2人microcolonies阻力进行了测试。 点击这里观看视频。 由淠绿突变体形成的视频 4。Microcolonies被打乱流量的增加（10达因/厘米2 ）。这种突变失败诱导质膜下microcolonies重塑，从而更高度敏感，增加剪应力（视频加速60倍）5。 点击这里观看视频。