セルカリア変換と in vitroで栽培マンソン住血吸虫 Schistosomules

安全対策： 住血吸虫セルカリアは直接カットや毛穴のニーズなく皮膚に浸透する、と慢性疾患の住血吸虫症を引き起こす可能性があります。S.マンソンは、バイオセーフティレベル2微生物であり、そのため感染のセルカリアで作業する場合、適切な個人用保護具と適切な安全対策に従う必要があります。住血吸虫の成長と変革するために必要な機材のほとんどは、プロトコルの末尾の表に記載されているいくつかの重要な例外を除いて、標準です。すべてのセルカリアの仕事は、隔離された部屋で行われるべきです。 Schistosomulesは、滅菌、承認されたバイオセーフティフードで培養する必要があります。実験用の上着、靴、穴や涙なしのパンツ、そして手首と腕用の防水スリーブプロテクタの防水ペアが必要として、ニトリルやラテックス手袋の二層は、着用してください。偶発的な流出の場合には、すぐにあなたの人になら、激しくこすり、70％エタノールまたは10％漂白剤で汚染されたエリアをスプレー。これは、寄生虫を無効にして十分ですが、すべての可能な感染症が報告され、真剣に取られるべきである。 schistosomulesが本質的に感染性はないが、制度的なガイドラインは変わる、とBSL2注意が非感染性の生命の段階で必要とされているかどうかを決定するために調べられるべきである。実験が行われ、承認バイオハザード容器に廃棄物を廃棄された後に感染性物質と接触するすべての表面を消毒する。 注記：カバーのカタツムリのホストのビン1〜2日前に捨て、光から保護するために 1。カタツムリのホストからセルカリアを収穫室温に蒸留水で半分フル洗剤の自由なきれいな、500ミリリットルビーカーを埋める。別の日にmiracidiumの複数形に感染したホストのカタツムリで作業する場合、（カタツムリが将来の実験のために再利用される場合、これは特に重要です）それぞれの感染の日付ごとに別々のビーカーを使用してください。ビーカーの大きさはまたユーザーの経験に応じて小さくすることができます。 あなたが当てると慎重に、必要に応じて標準的な観賞魚ネットと汎用の鉗子を用いてビーカーにそれらを堆積する感染カタツムリのホストを収集する。 緊急時の流出の上に置いてビーカーは白熱光源の下に約8〜12インチをトレイ。光の下で1-2時間放置する。明るい光にさらされるとセルカリアは、カタツムリのホストを終了します。 慎重にセルカリアの混合物からカタツムリを除外。混合物は非常に感染であるため、余分な安全予防策を講じる。 忘れないで、セルカリアは直接人間の皮膚に浸透することができます！ 任意の粒子の廃棄物が解決できるように、約15分間の光源下で混合物を交換してください。 ビーカーの底に破片を避け、ピペットを用いてきれいな三角フラスコにセルカリアを転送します。 60分、セルカリアが一角に定着できるようにすること – 45のための暗所で氷上で約45 °の角度でフラスコを置きます。 上清の75〜90％を除去し、10％の漂白剤または70％エタノールを入れたビーカーにそれを預ける、水滴がピペットからセルカリアのドリップを含むように注意しながら、50 mLのピペットを使用してください。 スワール三角フラスコは、溶液中のセルカリアを再懸濁させる優しくセルカリアを含む。滅菌50 mlコニカルチューブにサンプルを転送するためにピペットを使用してください。暗所で20分間氷上で再びチューブを置きます。セルカリアは暗闇の中でチューブの底に向かって沈殿します。 2。 schistosomulesにセルカリアの手動変換 作業を始める前に：RPMI 1640で完了（RPMI、5％ウシ胎児血清、1 ×ペン/連鎖球菌）と37℃まで暖かくしてください（これは、住血吸虫は、補完するように注意を払う必要があるとして使用されるウシ胎児血清で1時間インキュベーション56℃で不活性化されていることが重要です）。 バイオハザードフードでは、ピペッターまたは真空装置を使用して、各50 mlコニカルにおけるソリューション5〜10mlにダウン上清を取り除く。 適切なサイズのシリンジに22ゲージダブルエンド、ルアーロック乳化針を取り付けます。 ゆっくりと注射器に混合物を描く。シリンジ内のすべての50 mlチューブからセルカリアを収集する。滴下の気配りである。 慎重にアタッチされていない針の端が上になるように上の注射器を回します。乳化針のこの側面に別のシリンジを取り付けます。 セルカリアを変換するために針を通して40倍（20倍前後に）の合計を混合して渡す。 混合物が底の注射器に含まれており、トップシリンジが空であることを垂直にそのような注射器を置きます。トップシリンジを外し、70％エタノールで消毒。 きれいな高い壁に囲まれた100ミリメートルx 50mmのパイレックスの皿または結晶皿の中にドロップによる預金の混合物をドロップ。 70％エタノールで針と注射器を消毒する。 37℃のRPMI 1640完全なメディアがそのようなこと追加ルリアブロスプレートを注ぐかのようにペトリ皿の底は完全に、覆われている。 ペトリ皿の中央にschistosomulesを収集するために穏やかに渦巻く。水はねを避ける。 注：これは、より適切に中央にschistosomulesを視覚化するこのステップのためにボンネットのライトをオフにすると便利かもしれません。 直ちに滅菌スポイトを使用しても新鮮な12ウェル細胞培養プレートに集中schistosomulesを入金。 schistosomulesが皿の中心（約10倍）で、もはや存在しなくなるまで、2.9、2.10繰り返します。新鮮なだけでなく後続の各コレクションを入金。 よく、最大半分（〜1.5 mL）に温めておいたRPMI完全培地でそれぞれを埋める。 schistosomulesとセルカリアの不在の存在を確認するために倒立顕微鏡で視覚化する。 成長するCO 2インキュベーターでschistosomulesは37に設定されて℃、5％CO 2。 3。代表的な結果： 培養培地に変換schistosomulesの転送、保留中、反転明視野顕微鏡（例えば、機器の表を参照）の下で可視化は、変換schistosomulesがよく中に存在する1を、図に類似した画像を生成する必要があります。潜在的な汚染物質がそのままセルカリア、切断セルカリア尾、または他の破片を含めることができます。は倒立顕微鏡が利用できない場合は、標準的な顕微鏡あるいは解剖スコープはschistosomulesを可視化するために十分であろう。この手順は常にセルカリアの100％を変換しないことに注意してください。 図1：変換された幼住血吸虫 図2：セルカリアと断絶された尾