Transformation des cercaires et<em> In vitro</em> Culture de<em> Schistosoma mansoni</em> Schistosomules

Mesures de sécurité: Cercaires de schistosomes peuvent directement pénétrer la peau sans les besoins d'une coupure ou pores et provoquer la schistosomiase maladies chroniques. S. mansoni est un niveau de biosécurité 2 organisme, donc un équipement de protection individuelle et des mesures de sécurité appropriées doivent être suivies lorsque l'on travaille avec des cercaires infectantes. La plupart des équipements nécessaires à la croissance et à transformer les schistosomes est standard, à quelques exceptions près clés indiqués dans le tableau à la fin du protocole. Tous les travaux des cercaires devrait être fait dans une pièce isolée. Schistosomules doivent être cultivées dans un récipient stérile, la biosécurité approuvé le capot. Deux couches de nitrile ou des gants en latex doivent être portés, tout comme une blouse, une paire de chaussures imperméables, pantalons avec des trous ou de déchirures, et les protecteurs manches étanches pour vos poignets et des bras. En cas de déversement accidentel, pulvériser immédiatement zone contaminée avec de l'éthanol à 70% ou eau de Javel à 10%, frottant vigoureusement si sur votre personne.Ce sera suffisant pour désactiver le parasite, mais toutes les infections possibles doivent être signalés et pris au sérieux. Bien que schistosomules ne sont pas naturellement infectieux, directives institutionnelles varient et doivent être consultées pour déterminer si BSL2 précautions sont nécessaires lors des étapes de la vie non infectieuses. Désinfectez toutes les surfaces qui entrent en contact avec une substance potentiellement infectieux après l'expérience est effectuée et jeter les déchets dans un contenant approuvé biohazard. REMARQUE: bacs de couverture escargot hôte 1 à 2 jours avant la mue et protègent de la lumière 1. La récolte des cercaires de l'escargot hôte Remplir un gobelet propre et libre de 500mL détergents à mi-chemin plein avec de l'eau distillée équilibrés à température ambiante. Si vous travaillez avec des escargots hôtes infectées par miracidiums à des dates différentes, utiliser un bécher séparé pour chaque date d'infection (Ceci est particulièrement important si les escargots seront réutilisées pour future expériences). La taille du gobelet peut aussi être inférieur en fonction de l'expérience de l'utilisateur. Recueillir des mollusques hôtes infectés que vous souhaitez jeter et de les déposer avec précaution dans le bécher à l'aide d'un poisson d'aquarium standard net et une pince à usage général selon les besoins. Bécher place sur un bac de nettoyage d'urgence environ 8 à 12 pouces au-dessous d'une source incandescente. Laisser reposer pendant 1-2 heures, sous la lumière. Cercaires quitter le mollusque hôte lorsqu'il est exposé à la lumière. Soigneusement filtrer les escargots à partir du mélange des cercaires. Prenez des précautions supplémentaires, sous forme de mélange est très contagieux. Rappelez-vous, les cercaires peuvent directement pénétrer la peau humaine! Remplacer mélange sous source de lumière pendant environ 15 minutes, ce qui permet une matière particulaire de déchet à régler. Transfert cercaires dans un erlenmeyer propre à l'aide d'une pipette, en évitant les débris au fond du bécher. Placer le ballon à environ un angle de 45 ° sur la glace dans l'obscurité pendant45 – 60 minutes, ce qui permet cercaires de s'installer dans un coin. Utiliser une pipette 50 ml pour éliminer 75 à 90% du surnageant et le déposer dans le bécher contenant l'eau de Javel à 10% ou 70% d'éthanol, en prenant soin de ne pas laisser les gouttes d'eau contenant des cercaires goutte à goutte de la pipette. Agiter le flacon d'Erlenmeyer contenant des cercaires doucement pour remettre en suspension les cercaires en solution. Utiliser une pipette pour transférer l'échantillon à stériles tubes de 50 ml coniques. Placer les tubes à nouveau sur la glace pendant 20 minutes dans l'obscurité. Cercaires se déposent vers le bas du tube dans l'obscurité. 2. Transformation manuelle des cercaires à schistosomules Avant de commencer: Assurez-RPMI 1640 complet (RPMI, 5% de sérum fœtal bovin, 1X Pen / Strep) et chaude à 37 ° C. (Il est crucial que le sérum fœtal bovin utilisé a été inactivée par incubation de 56 ° C pendant 1 heure comme schistosomes peuvent être sensibles à compléter). Dans une hotte biohazard, retirezsurnageant jusqu'à 5 à 10 ml de solution dans chaque conique 50 ml à l'aide d'un dispositif de pipetage ou de vide. Joindre un calibre 22 à double extrémité, Luer lok émulsifiant aiguille d'une seringue de taille appropriée. Aspirer lentement le mélange dans la seringue. Recueillir des cercaires de tous les tubes de 50 ml dans une seringue. Soyez attentif de gouttes. Tournez avec précaution la seringue au cours de telle sorte que l'extrémité de l'aiguille seule est en place. Fixer une autre seringue de ce côté-ci de l'aiguille d'émulsification. Passer le mélange à travers l'aiguille un total de 40 fois (20 fois aller et retour) pour transformer les cercaires. Positionner verticalement les seringues de telle sorte que le mélange est contenu dans la seringue en bas et en haut de la seringue est vide. Retirer la seringue et désinfecter haut dans l'éthanol à 70%. Goutte à goutte dépôt mélange dans un récipient propre de hauteur x 50mm paroi 100mm plat en pyrex ou cristallisoir. Désinfectez l'aiguille et la seringue dans l'éthanol à 70%. Ajouter 37 ° C milieu RPMI 1640 complet de sorte que la inférieure de la boîte de Petri est entièrement recouverte, comme une plaque de coulée bouillon Luria. Agiter doucement pour recueillir schistosomules dans le centre de la boîte de Pétri. Éviter les éclaboussures. Remarque: Il peut être utile de désactiver la lumière de hotte pour cette étape de façon à mieux visualiser les schistosomules dans le centre. Déposer immédiatement schistosomules concentrés dans un nouveau de 12 puits de plaque de culture cellulaire et en utilisant un compte-gouttes stérile. Répétez jusqu'à ce que 2.9 et 2.10 schistosomules ne sont plus présents dans le centre du plat (environ 10 fois). Déposer chaque collecte ultérieure dans un endroit bien frais. Remplir chaque puits jusqu'à mi-course (~ 1,5 ml) avec milieu RPMI complet préchauffé. Visualisez sur un microscope inversé pour vérifier la présence de schistosomules et l'absence de cercaires. Cultivez les schistosomules dans un incubateur à CO 2 réglée à 37 ° C et 5% de CO 2. 3. Les résultats représentatifs: ove_content "> Dans l'attente de transfert des schistosomules transformés en milieux de culture, la visualisation en vertu d'un champ lumineux inversé microscope (voir tableau équipement pour un exemple) devrait donner une image similaire à la figure 1, dans laquelle seuls schistosomules transformées sont présents dans le puits. contaminants potentiels pourrait inclure des cercaires intacte, coupées queues cercariens, ou d'autres débris. Si aucun microscope inversé est disponible, un microscope standard ou même un champ de dissection sera suffisante pour visualiser les schistosomules. Notez que cette procédure ne permet pas toujours de transformer 100% de cercaires. Figure 1: schistosomule Transformé Figure 2: Severed cercaires et Tails