Cut-yükleme: Retina Nöronlar arasında Gap Junction Tracer Kaplin Kapsamı incelenmesi için yararlı bir araçtır

1. Japon balığı, fare ve tavşan için bozulmamış nöral retina hazırlıkları Sürekli ortam (arka plan) aydınlatma altında açıklanan olanlar da dahil olmak üzere aşağıdaki adımları, "2) Cut-yükleme," gerçekleştirin. Bu protokolün amacı, prosedürleri (yani çok karanlık (yani "scotopic") koşulları altında ≤ 0.0001 lux) gece görüş kızıl ötesi gözlük kullanarak sürekli karanlıkta olarak gerçekleştirilen açıklanan, ancak diğer yüksek yoğunluk seviyeleri sürekli ortam aydınlatma, unutmayın gap junction tracer kaplin ortam aydınlatma diğer seviyelerde etkisini belirlemek için yerine kullanılabilir. Koyu ameliyat öncesi en az 1 saat süreyle deneysel hayvan (Japon balığı, fare ve tavşan) uyum. Daha önce 7 açıklanan derinden tricaine methanesulfonate (MS222 balık deposu su tamponlu (sodyum bikarbonat içeren) 150 mg / L) koyarak goldfish uyutmak ve derin ketamin (100 mg olan farelerin uyutmak/ Kg, ip) ve rompun (10 mg / kg, ip). Derinden üretan ile tavşan uyutmak (yükleme dozu: 2,0 g / kg, ip) ve aynı zamanda yerel intraorbital anestezi (2% Xylocaine) kullanımı, daha önce 8 tarif. Hayvanların bakım ve kullanımını içeren tüm deneysel işlemleri federal kurallarına uygun olarak yapılmalı ve yerel üniversite hayvan bakımı ve kullanımı komiteleri tarafından gözden geçirilmeli ve onaylanmalıdır. (Not: burada açıklanan deneyler, balıkların bakımı ve kullanımı ile ilgili tüm deneysel prosedürleri, fare ve tavşan NIH kılavuzunda uygun olarak yapıldı ve incelendi ve Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan) Balık, fare ve tavşan için, aşağıdaki enükleasyon, her gözün ön kısmını kaldırın. Daha sonra, filtre kağıdı, gözün arka bölümünün altında böylece, gözün arka kısmının üstüne filtre kağıdı bir parçası yerleştirin ve filtre kağıdı ve göz ters. Daha sonra, ince kullanarakforseps yavaşça, nöral retina, filtre kağıdı bağlı, birbirlerine bağlıdırlar pigment epiteli / koroid / sklera, uzak soyma sağlam nöral retina gözün arka bölümünü teşrih. Bunu yaparken, ince yaylı makas kullanılarak optik sinir kesti. Nöral retina, fotoreseptör tarafı odaklı kadar, filtre kağıdı bağlı ve göz geri kalanından ayrılmış olmalıdır. 2. Cut-yükleme Ile sürekli ortam (arka plan) aydınlatma (örneğin, çok karanlık (yani "scotopic") koşulları altında) altında 30 dakika için bir 6-iyi plaka (~ 5 ml / iyi) olarak ya da olmadan oksijenli Ringer Kullanıcı çözüm (Tablo 1) Batmak retina Bir test ilaç. Parafilm ile 6-iyi plaka mühürleme oksijenli içinde balık retina (5% CO 2 /% 95 O 2) 22 bikarbonat-tabanlı Zil ° C koruyun ve bir% 5 CO 36 ° C fare ve tavşan retina korumak 2 / 95% O <sub> 2 inkübatör. Bir test ilaç kullanıldığı zaman, fiksasyon kadar sonraki tüm adımlar sırasında mevcut olmalıdır Ringer çözeltisi ile kesme retinanın hemen önce neurobiotin (% 0.5), bir biotinlenmiş molekülü eriterek izleme çözümü (genellikle 100 mcL) hazırlayın. % 0.5 rodamin dekstran (yüksek (> 10.000) MW) çözüm olabilir. Yüksek molekül ağırlığı nedeniyle, rodamin dekstran gap junction ve sadece etiket kesim tarafından zarar görmüş hücreleri geçemez. Şekil. 3, bu yaralandı çünkü gap junction aracılığıyla difüzyon tracer birikmiş bu neurobiotin biriken hücreler ayırt etmek için bir yoldur. Neurobiotin çözüm bir cam veya plastik Petri kabı yerleştirin, aşırı Zil kaldırmak neurobiotin çözümü bir jilet (ya da başka bir keskin bıçak) daldırma ve retinaya bağlı olduğu filtre kağıdı, kağıt havlu üzerine dokununn retina ve filtre kağıdı ile radyal bir kesim olun. Ayırıcılar Tercih edilmesi durumunda, retina ile yapılan kesme, ancak filtre kağıdı olduğunu kullanılmalıdır olabilir. Kesilen retina yüzeyine dik odaklı olmalıdır. Neurobiotin çözüm jilet tekrar batırın ve retina ikinci kez kesmek. Retinanın başına 4 kesim (bkz. Şekil 1) Bu kadar tekrarlayın. Fare ve diğer küçük retina aracılığıyla jilet keser yaparken bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Şekil. 6 plaka (5 ml Ringer / kuyu) kullanarak ya da test ilaçsız 1, batığın taze Ringer ortamda tekrar retina,. Retina, yükleme ve difüzyon izin vermek için 15 dakika süreyle inkübe edin. 5 dakika, her taze Ringer orta ile veya test ilaçsız üç kez yıkayın. % 4 paraformaldehid oda sıcaklığında 1 saat için 0.1 M fosfat tamponu (PBS, pH 7.4) ile retina sabitleyin. 4 gecede 0,1 M PBS ile yıkayın ° C Ertesi gün, tepki wi. 0.1M PBS streptavidin-Alexa 488 (son konsantrasyonu 10 mg / ml) +% 0.3 Triton X-100,% 2 ve 4 gecede tutmak ° C 10 dakika her RT 0.1M PBS ile üç kez yıkayın PBS, ince bir fırça kullanarak, retinaya sonra filtre kağıdı ayırmak ve bir slayt üzerine, retina, fotoreseptör-yüzü yukarı odaklı yerleştirin. Yavaşça Vectashield montaj orta (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ile monte edin. Ölçüde, farklı deneysel koşullar (aydınlatma koşulları örneğin test ilaçlar) etkilerini karşılaştırmak böylece, deneysel her durum için aynı büyütme, çözünürlük ve ayarları konfokal mikroskobu (örneğin Zeiss 510 META) bir lazer tarama ile fotoğraf çekmek gap junction tracer kavrama (Şekil 2A-C ve Şekil 4A-C). Etiketli tüm hücreleri tek bir görüntü içeriyor olsa da, ilgi alanı z-yığını toplamak ve tek bir sözlük tavsiyegörüntü. 3. ImageJ kullanarak tracer kaplin Kantitasyonu LSM görüntü tarayıcısı, görüntüyü açmak, İHRACAT tıklayın ve dosya sıkıştırıldığında sonuçlanır TIF-16 bit olarak resmi kaydedin. Ölçek çubuğu bu TIF resim dahil edilmelidir. NIH ImageJ yazılımı kullanarak, tüm montaj retina düşük büyütmeli görüntü Alexa-488-etiketli neurobiotin floresan yoğunluğu ölçmek. ImageJ yazılımını kullanarak, TIF dosyası açın ve ölçek çubuğuna karşılık düz bir çizgi çizin. ANALİZ SCALE SET ve bilinen bir mesafe ve uzunluk birimi girin, sonra Tamam'ı tıklatın. Şimdi ölçüm sonuçları bu milimetre olarak kalibre üniteleri, sunulabilir. Dikdörtgen seçim aracını kullanarak ilgi alanı seçin. Floresan tepe seçim sol sınırında yerleştirilmelidir. Sağ sınırına yakın bir floresan sinyal olmadığından emin olun. Aksi takdirde, aktif (RESİM, sonra ROTATE) döndürün. TıklayınANALİZ ve PROFİLİ ARSA. , Soldan sağa doğru bir üstel bozulma ile bir eğri göreceksiniz. Pop-up penceresi KOPYA tıklayın ve EXCEL yapıştırın. Şimdi mesafenin bir fonksiyonu olarak kesme kesme (sol sütun) ve floresan (sağ sütun) mesafe gösteren iki sütun bakın. Maksimum floresans değeri göreli floresan yoğunluğu elde etmek için her çiğ floresan değeri bölün. Sonra kesme (X) ve (Y) göreli floresan mesafe karşılık gelen ve Kopyala iki sütun Kökeni yazılım içine yapıştırın. Üstel bozulma şeklinde # 1 fonksiyonu (Şekil 2D ve Şekil 4D), Fit: Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ) Burada Y göreli floresan, Y o eşiğe, Y max maksimum bağıl floresan, λ space (uzunluk) sabit ve x kesim mesafedir. T-testi veya ANOVA (Şekil 2E ve Şekil. 4E) kullanarak farklı deneysel koşullar altında uzay sabiti (λ) değerleri karşılaştırın. Not nicelikleme alternatif teknikler, başkaları 13,14 tarafından tarif edilmiştir . 4. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 2 ve 3 (balık) ve Şekil 4 (tavşan) yükleme kesim tarafından belirlenen kaplin fotoreseptör hücre tracer Temsilcisi örnekler sunulmuştur. Konfokal görüntüler kesim mesafe bir fonksiyonu olarak çizilen ve yukarıdaki No 3.8 'de gösterildiği üstel fonksiyonu ile donatılmış karşılaştırma (Şekil 2A-C ve Şekil 4A-C) ve floresan yoğunluğu için aynı ayarları kullanarak alındı (Şekil 2D ve Şekil 4D). Uzay her bir durum için sabit değerlergap junction tracer kaplin ölçüde kesilmiş yükleme tekniği kullanılarak sayısal olabileceğini gösteren, 2E, 4E Rakamlarla gösterilmiştir. Buna ek olarak, yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar. Gap junction tracer kaplin ölçüde nicel bir araç olarak yükleme kesim tekniği kullanın floresans şiddeti her durumda kesme mesafenin bir fonksiyonu olarak katlanarak azalır bulgu tarafından da doğrulanır (7,8 incelendiğinde de Şekil bakın. neurobiotin, diğer retina sitelerinden jilet kesim ve ile fotoreseptör girdiğinizi belirten 2D ve 4D) . Ayrıca, fotoreseptör hücre tracer kaplin niteliksel benzer gündüz / gece fark tek koniler tracer enjeksiyonları ile goldfish ve kesme yükleme 7 ile gözlenen fotoreseptör kaplin ölçüde ölçme nispeten doğru bir araç olarak kesilmiş yükleme çiziyor. Kesme-lretinanın elektriksel sinaps diğer türlerini araştırmak için ukleniyor tekniği de kullanılabilir. Örneğin, Şekil 5, A-tipi (Şekil 5A) ve B tipi (Şekil 5B) yatay hücreler tracer kaplin homolog sergileyen bu tavşan göstermektedir aşağıdaki cut-yükleme ve koyu adapte koşullar altında neurobiotin yayılması . Bileşik Balık Fare Tavşan NaCl 130 120 117 NaHCO 3 20 25 30 NaH 2 PO 4 – 1 0,5 KCL 2,5 5 3,1 Glikoz 10 10 10 MgCl 2 1 – – MgSO 4-7H 2 O – 1 1,2 Glutamin – 0,1 0,1 CaCl 2 0,7 2 2 Tablo 1: Zil çözümleri goldfish, fare ve tavşan retina Kompozisyon. Konsantrasyonlarda mM sunulmaktadır. Zil çözümleri kabarmış ve% 5 CO 2 /% 95 O 2 ile 22 ° C (balık) veya 36 ° C (memeliler) korunur. "-": Bu türler için Zil dahil değildir. Şekil 1: cut-yükleme prosedürü gösteren akış şeması. İzolasyon o sonraf sağlam nöral retina, birkaç radyal ilk kez% 0.5 'lik neurobiotin çözeltisi batırılmış bir bıçak keser tarafından yapılmıştır. Retina tracer yükleme ve difüzyon inkübe ve sonra 0.1M fosfat tamponu (PB)% 4 paraformaldehid (PFA) ile tespit önce yıkandı. Tracer kaplin Alexa-488 streptavidin-konjuge kullanılarak incelenmiştir. Şekil 2 goldfish fotoreseptör tracer kaplin gün-gece fark yükleme kesme tekniği ile ortaya çıkar. Fotoreseptör hücre gap junction neurobiotin tracer kaplin, kontrolü koşullar altında (A) gün içinde spiperone (10 mcM), seçici bir dopamin D 2 reseptör antagonisti (C) uygulaması sonrasında gece (B) ve gün içinde yoğun olduğunu, ancak . D) Normalize kesim mesafe (AC oklarla gösterilen) bir fonksiyonu olarak göreceli floresan yoğunluğu. E) Uzay sabit valD ve diğer deneyler (n = 4) veri elde ues. *** P <0.001. Şekil 3 neurobiotin ve rodamin dekstran hem de bir çözüm ile kesme yükleme ertesi gece karanlık bir adapte goldfish retina fotoreseptör hücre tabakası floresans gösteren bir temsili örnek. Yüksek molekül ağırlıklı (> 10.000 MW), sadece kesme yakın etiketli hücreleri nedeniyle açık gap junction kanalları aracılığıyla diffüz değildir rodamin dekstran (kırmızı ile gösterilen). Buna karşılık, gap junction dağılmıştır neurobiotin (yeşil renkte) ve fotoreseptör hücrelerin kesim uzak görülebilir. Kesim yeri her panelinde ok ile belirtilir. Ölçek çubuğu: 200 mm. Şekil 4 gün-gece farklı.tavşan retinada kaplin fotoreseptör tracer varlığı, kesme yükleme tekniği ile ortaya çıkar. Fotoreseptör hücre gap junction neurobiotin tracer kaplin, kontrolü koşullar altında (A) gün içinde spiperone (10 mcM) (C) uygulaması sonrasında gece (B) ve gün içinde yoğun olduğunu, ancak. AC, dik kesme yakın tavşan fotoreseptörlerin 3D rekonstrüksiyon kez gösterilmiştir. D) Normalize keser mesafenin bir fonksiyonu olarak göreceli floresan yoğunluğu. E) Uzay sabit değerler, D ve diğer deneyler (n = 3) verilerden elde edilmiştir. *** P <0.001. Şekil 5 Kes yükleme koyu adapte tavşan yatay hücreler tracer birleştiğinde ortaya koymaktadır. A-tipi (A) ve B tipi (B) yatay koyu adapte tavşan retina hücreleri homolog neurobiotin tracer kaplin sergilenmektedir.