Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch
Summary
Eine Methode ist beschrieben, um einzelne Zellen mit einem Käfig fluoreszierenden Proteins mit Zwei-Photonen-Absorption aus einer Ti photoaktivieren: Sapphire Femtosekunden-Laser-Oszillator. Um das Schicksal der Karte photoaktivierte Zelle, ist die Immunhistochemie verwendet. Diese Technik kann auf jeden Zelltyp angewendet werden.
Abstract
Die Fähigkeit, differenziert label Einzelzellen hat wichtige Auswirkungen in der Entwicklungsbiologie. Zum Beispiel bestimmen, wie hämatopoetischen, lymphatischen und Blutgefäß-Linien in sich entwickelnden Embryonen entstehen erfordert Schicksal Mapping und Abstammung Verfolgung von undifferenzierten Vorläuferzellen. Kürzlich photoaktivierbaren Proteine, die zählen: haben Eos 1, 2, PAmCherry 3, Kaede 4-7, pKindling 8 und KikGR 9, 10 breites Interesse als Zell-Tracing-Sonden aufgenommen. Das Fluoreszenzspektrum von diesen lichtempfindlichen Proteine lassen sich mit UV-Anregung umgewandelt werden, so dass eine Population von Zellen aus benachbarten unterscheiden. Allerdings kann die photoefficiency des aktivierten Protein Grenze langfristige Zelltracking 11. Als Alternative zu photoaktivierbaren Proteine hat caged Fluorescein-Dextran weithin in Embryo-Modell Systeme 7, 12-14 verwendet. Traditionell zu Uncage Fluorescein-Dextran, UV-Anregung aus einem Fluoreszenz-Lampe Haus oder ein einzelnes Photon UV-Laser verwendet wurde, jedoch begrenzen solchen Quellen die räumliche Auflösung der Photoaktivierung. Hier berichten wir über ein Protokoll, das Schicksal Karte, Linie zu verfolgen und erkennen einzigen markierten Zellen. Einzelne Zellen in Embryonen mit caged Fluorescein-Dextran injiziert werden mit Nahinfrarot-Laser-Pulsen aus einem Titan-Saphir-Femtosekundenlaser erzeugt photoaktivierte. Dieser Laser ist in allen Zwei-Photonen konfokalen Mikroskopen wie dem LSM 510 META NLO-Mikroskop in diesem Dokument verwendet üblich. Da biologisches Gewebe ist transparent für Nah-Infrarot-Bestrahlung 15 kann die Laserpulse tief im Inneren des Embryos ausgerichtet sein, ohne Uncaging Zellen oberhalb oder unterhalb der ausgewählten Bildebene. Daher ist nicht-lineare Zwei-Photonen-Absorption nur im geometrischen Mittelpunkt bewogen, Fluorescein-Dextran in einer einzigen Zelle Uncage. Zum Nachweis der Zelle mit uncaged Fluorescein-Dextran, beschreiben wir eine einfache immunhistochemischen 16 bis schnell visualisieren activated cell. Die Aktivierung und Detektion Protokoll in diesem Beitrag vorgestellte ist vielseitig und kann zu jedem Modell aufgebracht werden.
Hinweis: Die Reagenzien werden in diesem Protokoll kann in der Tabelle am Ende des Artikels angehängt gefunden werden.
Protocol
Discussion
Dieses Papier beschreibt eine vielseitige Methode für einzelne Zelle Schicksal Zuordnung auf dem Photoaktivierung von caged Fluorescein-Dextran basiert. Uncaging von caged Fluorescein-Dextran in einzelnen Zellen erfolgt mittels Zwei-Photonen-Absorption aus einem Mai Tai Femtosekundenlaser gekoppelt an die Zeiss LSM 510 META konfokalen Mikroskop. Uncaged Fluorescein-Dextran in photoaktivierte Zellen schnell visualisiert mit Hilfe eines einfachen Verfahrens Immunhistochemie.
In diesem Protokoll werden die Zwei-Photonen-Absorption Wellenlänge für Photoaktivierung von caged Fluorescein-Dextran 740 nm. Diese Wellenlänge wurde experimentell durch photoaktivierenden caged Fluorescein-Dextran injiziert Wildtyp Embryonen bestimmt. Die Anregungswellenlänge des Lasers wurde von 600 bis 800 nm variiert, und das Vorhandensein oder Fehlen von Fluorescein-Fluoreszenz post-Aktivierung wurde qualitativ bestimmt. Wir fanden, dass 740 nm am stärksten Fluorescein-Signal nach der Aktivierung erzeugt. Idealerweise sollte 740 nm für alle Modell-Systemen arbeiten, aber wir raten Testen einer Bandbreite von Wellenlängen, um die optimale Zwei-Photonen-Anregungswellenlänge für Ihre Probe zu bestimmen.
In Käfigen Fluorescein-Dextran injiziert Wildtyp Embryonen, für jeden Zwei-Photonen-Anregungswellenlänge testeten wir auch variiert die durchschnittliche Laserleistung. Für eine Anregungswellenlänge von 740 nm, eine mittlere Laserleistung von 47 mW erzeugt eine stärkere Fluorescein-Signal an der aktivierten Region im Vergleich zur durchschnittlichen Laserleistungen zu senken. Höhere durchschnittliche Laserleistungen nicht produzieren stärkere Fluorescein-Signale, sondern induzierte Ablation des Gewebes. Da Femtosekunden-Laserpulsen bei Ablation von biologischem Gewebe 15 sind effiziente, empfehlen wir die Bestimmung der Schwelle mittlerer Laserleistung für Photoaktivierung, dass Gewebeablation vermeidet.
Zwei-Photonen-Absorption liegt in einem kleinen Volumen Interaktion. Um eine ordnungsgemäße Aktivierung von caged Fluorescein-Dextran, muss die Zelle in die richtige Fokus gebracht werden. In dem obigen Protokoll wurden GFP-positiven Zellen gleichzeitig unter weißem Licht abgebildet, um Zell-Fokus zu bestätigen. Daher ist weißes Licht Übernahme zusätzlich zu den anderen Kanälen sinnvoll. Nach der Bestätigung Zelle zu konzentrieren, schlägt unser Protokoll Vergrößerungsglas der aktivierten Zelle. Ein Zoomfaktor von 50 bis 70 vorgeschlagen wird, hängt jedoch von diesem Wert auf die Größe der ausgewählten Zelle. Die Erhöhung der Zoom-Isolate der aktivierten Zelle von benachbarten Zellen, und die Grenzen der Scan-Bereich für Zwei-Photonen-Aktivierung. Idealerweise sollte der Scan-Bereich decken einen großen Bereich der Zelle.
Detektion von einzelnen aktivierten Zellen erfordert, dass die Hintergrundfärbung minimal sein. In der oben Immundetektion Protokoll ist es wichtig, dass die Probe in Blocking-Puffer für 5 bis 6 Stunden (Schritt 4,13) blockiert ist. Bei der Entwicklung mit NBT / BCIP, uncaged Fluorescein-Dextran sollte sichtbar in 10 bis 20 Minuten. Wenn Hintergrundfärbung stark ist, schlagen wir vor, eine längere Sperrzeit und zusätzliche Wäschen an den Antikörper (Schritt 4,17) zu entfernen.
Abbildungen 1 und 2 liefern repräsentative Ergebnisse Photoaktivierung und Immundetektion. In Abbildung 1, Anfang der 1 – bis 2-Zell-Stadium Wildtyp Embryonen wurden mit caged Fluorescein-Dextran injiziert. Die Embryonen wurden bis Mitte Somitogenese angehoben und montiert in niedrig schmelzender Agarose in die seitliche Ausrichtung. Abbildung 1 (a, b) zeigen Hellfeld-und Fluoreszenz-Bilder des Embryos vor Photoaktivierung. Der Nachweis, dass der Embryo uncaged geblieben ist, ist durch das Fehlen von Fluorescein-Fluoreszenz in Abbildung 1 (b) gezeigt. Eine kleine Region innerhalb eines Somiten wurde mit einer Wellenlänge von 740 nm für 31 Sekunden mit einer mittleren Laserleistung von 47 mW, Abbildung 1 (, Pfeil c) aktiviert. Post-Aktivierung, Zwei-Photonen-Uncaging von Fluorescein-Dextran aufgetreten, als durch die Fluoreszenz von den aktivierten Bereich, Abbildung 1 (d; Pfeil). Die Aktivierung war nicht durch Laserablation begleitet, da die somitic Gewebe intakt geblieben, Abbildung 1 (c). Abbildung 2 zeigt die Immundetektion von uncaged Fluorescein-Dextran. Eine kleine Region im lateralen Mesoderm eines 10-Somiten-Stadium Embryo photoaktivierte mit dem gleichen Laser-Parameter wie in Abbildung 1 erwähnt. Der Embryo wurde erhoben und verarbeitet unter Verwendung der Schritte 4.1 bis 4.20. Der Pfeil in Abbildung 2 lokalisiert die Region aktiviert, da durch die Ansammlung von blauen Niederschlages angezeigt. Nur die aktivierten Lage ist klar, ohne störende Hintergrundfärbung erkannt.
Herstellung von Lösungen:
1 X PBT (1 L)
100 ml 10 X PBS
2 g BSA
10 ml 20% Tween
10 X PBS (1 L)
80 g NaCl
2 g KCl
6,1 g Na 2 HPO 4
1,9 g KH 2 PO 4
ddH 2 O auf 1 L
pH auf 7,3
4% Paraformaldehyd (160 ml)
32% Paraformaldehyd (zwei 10-ml-Fläschchen)
8 mL 20 X PBS
132 ml ddH 2 O
1 mL 5 M NaCl
2,5 ml 1 M MgCl 2
5 mL 1 M Tris pH 9,5
250 ul 20% Tween
41,25 mL ddH 2 O
Antikörper-Lösung (für 1 Probe)
5,5 ul Aceton Pulver
40 ul PBT
0,8 ul LS
0,1 ul Anti-Fluorescein-AP-Antikörper
2% LS (360 ul für 1 Probe)
7,2 ul 100% LS
352,8 ul PBT
1 X Danieau Medien (1 L) ‡
11,6 ml 5 M NaCl
700 ul 1 M KCl
400 ul 1 M MgSO 4
600 ul 1 M Ca (NO 3) 2
5 mL 1 M HEPES
ddH 2 O auf 1 L
pH auf 7,6 einstellen
‡ Danieau ist eine ideale Salzlösung für die Aufzucht dechorionated Zebrabärblinge. Andere Medien verwendet werden können, vorausgesetzt, sie sind isotonische Lösungen mit richtig Osmolarität (~ 300 mOsm für Zebrafisch)
NBT Lager (1 ml)
50 mg Nitro Blue Tetrazolium
0,7 ml Dimethylformamid Anhydrid
0,3 ml ddH 2 O
BCIP Lager (1 ml)
50 mg 5-Brom-4-Chlor-3-indolylphosphat
1 mL Dimethylformamid Anhydrid
NBT / BCIP Entwicklerlösung
1 mL AP-Puffer
4,5 ul NBT Lager
3,5 ul BCIP Lager
Acetonpulver
- Wählen Sie 20 ausgewachsene Fische und frieren sie in flüssigem Stickstoff.
- Grind der gefrorenen Fisch mit einem Mörser und Stößel, um ein Pulver.
- Übertragen Sie die Fische Pulver in ein 50 ml konischen Röhrchen.
- Füllen Sie den konischen Rohr mit 100% Aceton. Vortex die Röhre.
- Drehen Sie das Rohr bei max rpm für 10 Minuten. Überstand verwerfen.
- Waschen des Pellets noch 3-mal in 100% Aceton und drehen Sie das Rohr bei max rpm für 10 Minuten. Mit dem letzten Waschgang der Überstand sollte klar.
- Add 100% Aceton, das Pellet wieder und lassen das Rohr bei Raumtemperatur stehen gelassen. Je dichter Teilchen entscheiden wird, während die feineren Partikel in der Schwebe bleiben.
- Dekantieren die feinen Partikel in eine neue Röhre. Aliquot des Pulvers Lösung in getrennten Röhren und lagern Sie sie bei -20 ° C.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken J. Chen für die Bereitstellung der Käfig Fluorescein-Dextran-Synthese-Protokoll. Diese Arbeit wurde von der March of Dimes Auszeichnung 5-FY09-78, die American Heart Association Award 09BGIA2090075 unterstützt, und die NIH / NHLBI Auszeichnung R01 HL107369-01 bis SS Ein besonderes Dankeschön an C. Closson für seine Mikroskopie Hilfe.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce | 89889 |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A |
| Anti-fluorescein-AP | Roche | 11376622 |
| Blocking buffer | Roche Applied Sciences | 11 096 176 001 |
| Maleic Acid | Sigma | MO375-500G |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 |
| NBT | Sigma | I8377-250mg |
| BCIP | Fischer Scientific | PI-34040 |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc International | 155380 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 |
| LSM 510 META NLO | Zeiss | |
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Zeiss | |
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
Referências
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