מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

Bisulphite המרה פרוטוקול פרוטוקול סטנדרטי עבור ההמרה של 2 מיקרוגרם של הדנ"א הגנומי מתואר להלן. כמויות קטנות יותר או גדולות יותר של הדנ"א הגנומי (100 PG-200 מיקרוגרם) יכול להיות גם bisulphite מטופלים בהצלחה. אלה התנאים התגובה התוצאה המרה מלאה (99.5-99.7%) של כמעט כל רצף ה-DNA היעד 3. 1. ה-DNA הכנה הכינו דגימות הדנ"א הגנומי ידי דוגרים עם הצפת תמוגה bisulphite דנ"א (2 מיקרוגרם t-RNA, 280 ng / μl proteinase K, 1% SDS) בהיקף כולל של 18 μl עבור שעות 1 ב 37 ° C. הערה: זה חשוב כדי להשיג bisulphite המרה מירבית, במיוחד עם ה-DNA שבודד דגימות קליניות שם עדיין עשויה להיות קשורה חלבון ה-DNA. 2. ה-DNA denaturation לפגל 2 מיקרוגרם DNA בנפח של 20 μl על ידי הוספת 2 μl של המוכן טרי 3M NaOH ל ג הגמרoncentration של 0.3M. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות באמבט מים, ואחריו הדגירה על 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות בתוך גוש חום. מיד למקום צינורות על קרח דק '5. צנטריפוגה צינורות ב 4 מעלות של 10 גרם ב 10,000, כדי להבטיח את ה-DNA הוא בתחתית של התחתית. 3. Bisulphite Deamination Sulphonation & Deamination hydrolytic הכינו פתרונות טריים של 10 Quinol רווי mM נתרן metabisulphite pH 5.0 (7.6 גרם Na 2 S 2 O 5 עם 464 μl של 10 M NaOH, עשה עד 15 מ"ל מים). הפתרון של bisulphite נתרן רווי מושגת על ידי היפוך בעדינות את תערובת מגיב / H 2 O, עם ערבוב מינימלי אוורור. במידת הצורך, להתאים את ה-pH עם 10 M NaOH, עבור פירוק מלא של metabisulphite הערה:. כפי שהוא פתרון רווי, גושים קטנים עדיין יכולים להישאר שלא נמסה. הוספת 208μl של metabisulphite רווי 12 μl של Quinol 10mm ל-DNA מפוגל (20 μl), נפח סופי של 240 μl לריכוז סופי של 2.31M bisulphite/0.5mM Quinol, pH 5.0. בעדינות מערבבים את כל ריאגנטים צנטריפוגות במשך 10 שניות בלבד כדי להבטיח את כל הטיפות נמצאים בתחתית של התחתית. כיסוי דגימות עם 200 μl של שמן מינרלי. דגירה דגימות ב 55 מעלות צלזיוס באמבט מים, במשך 4-16 שעות. אורך הטיפול bisulphite תלוי בכמות ובאיכות של ה-DNA להיות מומר. עבור ה-DNA באיכות ירודה או דנ"א מושפל, להגביל את זמן הדגירה עד 4 שעות. הערה: חשוב כי ההמרה bisulphite מתקיים בחושך, כדי למנוע חמצון, כך שאם זה לא ניתן לעטוף את הצינורות בנייר כסף לפני הדגירה . בתום זמן הדגירה מתאים, לסובב את הצינורות בקצרה microcentrifuge כדי להבטיח את כל הנוזל בתחתית הצינור. שחזר את ה-DNA טיפול bisulphiteמתחת לשכבת הנפט על ידי בקפידה pipetting את פתרון ה-DNA מהחלק התחתון של הצינור, בלי לקחת את כל שמן מינרלי. Desalting הסר את כל היונים bisulphite חינם על ידי עובר דרך עמודה desalting ו משחררי ב μl של 50 מילי-Q מים (MQH 2 O). תלוי בכמות ובאיכות של הדנ"א הגנומי ואיך הוא מוכן, טורים desalting שונים יכולים לשמש. אנו משתמשים באופן שגרתי Promega אשף ניקוי עמודות, כמו עמודות אלה מתאימים להסיר SDS המשמש בהכנת ה-DNA לפני ההמרה. אלקליות Desulphonation Adduct bisulphite יוסר הטבעת אורציל ידי desulphonation. Desulphonate ידי הוספת 5.5 μl של המוכן טרי 3M NaOH ריכוז סופי של 0.3M, אז דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. צנטריפוגה בקצרה ולהוסיף 1 μl של t-RNA (10 מ"ג / מ"ל). <li> מנטרלים את הפתרון על ידי תוספת של 33 μl של אמוניום אצטט (NH 4 O Ac), pH 7.0 עד ריכוז סופי של 3M. אתנול, להאיץ את ה-DNA על ידי הוספת 330 μl של אתנול קרים 100%, ומערבבים היטב על ידי היפוך. השאר ב-20μC עבור שעות 1 עד לילה. צנטריפוגה ב g 14,000 עבור 15 דקות ב 4 ° C. הסר את כל עקבות של supernatant ואוויר יבש זירז את ה-DNA של ~ 20 דקות. Re-להשעות את גלולה דנ"א μl 50 / מיקרוגרם של 0.1 TE (10mm טריס-HCL, 0.1mm EDTA, pH 8.0) או H 2 O. השאירו בטמפרטורת החדר למשך כ 2hrs. מערבולת מדי פעם הצינורות כדי להבטיח את ה-DNA הוא מומס, ואחריו צנטריפוגה מהירה. השתמש מיד הגברה PCR, או לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך 1-10 שנים, תלוי בכמות ואיכות ה-DNA. 4. PCR הגברה פריימר עיצוב תכנון יעיל של ה-PCR bisulphite המרה ספציפי primers הוא cruciaאני להבטיח כי הגברה יעיל, מוטה לחלוטין של ה-DNA המרה מתרחשת. הקווים המנחים הבאים משמשים כדי לסייע בעיצוב פריימר. עיצוב פריימר הנחיות Thermocyling כדי לבדוק הגברה PCR היחסי של ה-DNA ואת מפוגל unmethylated, השתמש 50:50 מפוגל / Unmethylated bisulphite מלא מדגם לשלוט המרה ולהגביר עם bisulphite ספציפי המרה primers בתנאים אופטימיזציה תגובת PCR (איור 3). עבור מפוגל 50:50: שליטה Unmethylated, להשתמש ב-DNA במבחנה SssI מפוגל ואו הגנום כולו מוגבר (WGA) דנ"א או דנ"א דם כולו. שים לב כמה גנים יהיו מפוגל באופן טבעי בדם, ולכן במקרים אלה עדיף להשתמש רק WGA ה-DNA כמו שליטה "Unmethylated". הכנת תערובות תגובת PCR הגברה ב 100 & mu; aliquots אני המכיל 2 μl של ה-DNA הגנומי bisulphite המרה, 200 מיקרומטר dNTP 1, primers מיקרומטר, 1.5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10mm טריס-HCL, pH 8.3 ו 0.15 פולימראז תקי μl. ב thermocycler שיפוע טמפרטורה, קבע את התגובה לרוץ צבע + / – 3 מעלות צלזיוס מן אני החזוי של פריימר על פני 10 צינורות כדי לבדוק כי amplicons מפוגל ו unmethylated כבר מוגבר בפרופורציות, amplicon יכולים להתעכל עם אנזים הגבלה אינפורמטיבי, כגון תקי 1 (TCGA), כי יהיה לעכל דנ"א מפוגל אך לא לעכל דנ"א unmethylated כאשר האתר הוא אנזים הגבלה שינה לאחר ההמרה bisulphite כדי TTGA. היקף העיכול ניתן דמיינו ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose (איור 3A). לחלופין, SYBRGreen (0.2 μl של דילול 1:1000) ניתן להוסיף את תגובת ה-PCR והיקף מתילציה ניתן להעריך על ידי ביצוע חום מגרשים דיסוציאציה בזמן אמת PCR thermocycler (איור 3B). לערבב PCR תגובת כולל MgCl 2 תנאים ריכוז thermocycling ייתכן שיהיה צורך להתאים כדי להגביר את יעילות ה-PCR או כדי להבטיח הגברה PCR היחסי של שברי PCR מפוגל ו unmethylated. ברגע התנאים PCR מותאמים, הגברה PCR יכול להתבצע על דגימות המרה bisulphite. הערה: לאחר אני מותאם טמפרטורה הדרגתי PCR לא צריך להיות בשימוש. 5. נציג תוצאות: דוגמה אופטימיזציה הגברה PCR bisulphite מוצגת באיור 3. תנאים אופטימליים PCR הגברה צריך להגביר amplicons מפוגל ו unmethylated בפרופורציה וללא משוא פנים. איור 3A מציגה ג'ל agarose עם פרופיל שיפוע הטמפרטורה הגברה PCR מתערובת של DNA ו – 50% מפוגל unmethylated. ה 'דואר amplicons PCR טופלו אנזים הגבלה, תקי 1 (TCGA), כי יהיה לעכל מפוגל (M) DNA אך לא לעכל unmethylated (U) הדנ"א באתר אנזים ההגבלה משתנה על ידי המרה bisulphite כדי TTGA. כמות שווה של לחתוך נימול מוצר PCR צפוי אם ה-DNA ואת מפוגל unmethylated מוגבר בפרופורציה. ניתן לראות על ג'ל זה שהתנאים thermocyling הגברה אופטימלית ללא משוא פנים נמצאת 56.1 ° C (T). המרה מלאה של ה-DNA bisulphite יכול גם להיות מנותח על ידי אנזים העיכול עם ציטוזין לאתר ספציפי כגון HPA III (CCGG). HPA III רק לעכל אם ההמרה נכשלה, כמו באתר הגבלה יישמר. אם השלמת ההמרה באתר הגבלה יומרו TCGG או TTGG בהתאם למצב המתילציה של הדנ"א. ה-DNA השלם המרה bisulphite ניתן לראות באיור 3 א (ג). איור 3 ב מציג עלילה אמיתית דיסוציאציה זמןיכול לשמש גם ככלי כדי לקבוע אם יש הטיה הגברה המבוססת על בטמפרטורה שבה מולקולות שונות יהיה לנתק. בתרשים זה ניתן לראות כי ה-PCR יש מוגבר מפוגל (M) ו unmethylated (U) DNA ביחס מתערובת של DNA ו – 50% מפוגל unmethylated לעומת הגברה הבקרה של ה-DNA מפוגל מלא unmethylated אשר לנתק את 82.1μC ו 78.9μC בהתאמה. אחרי אופטימיזציה של thermocyling ותנאי התגובה Bisulphite דגימות טיפול יכול להיות מוגבר עם פריימרים ספציפיים גדיל bisulphite ספציפית או תגובה אחת או חצי PCR מקוננות. שברי כתוצאה PCR ניתן דמיינו ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose ואת רצף במישרין (איור 4 א) או על ידי שיבוט וסדר. לאחר שיבוט רצף המדינה מתילציה של מולקולות בודדות ניתן tabulated, במפה bisulphite (איור 4B), כדי להמחיש את ההטרוגניות שלמתילציה. תפוקה גבוהה כמותי וניתוח מתילציה ניתן preformed שימוש בטכנולוגיה כגון זה מנוצל על ידי שיטת EpiTYPER Sequenom. באמצעות שיטה זו, ה-DNA המרה bisulphite מוגבר עם bisulphite ספציפי PCR primers ואחריו תהליך מחשוף proprietry. שברים כתוצאה מכך הם ונרשמת ידי ספקטרומטריית MALDI-TOF המוני עם ספקטרום ספציפי תלויה בנוכחות cytosines מפוגל (איור 5A). סיכום יחסי מתילציה במדגם לאחר מכן ניתן להסיק בצורת מכתם (איור 5 ב) או עלילה מתילציה (איור 5 ג). באיור 1. סכמטית CPG מפוגל. בתא נורמלי, האמרגן-CPG הקשורים האיים הם בעיקר unmethylated (אפור) ואילו אתרי CPG בתוך גופים הגן הם בדרך כלל דליל מפוגל (אדום). הפאנל בצד ימין מרחיבה את struct מולקולריתיור של ה-DNA באתר CPG הפרט מראה מתילציה עם מולקולה CH3 על פחמן 5 של ציטוזין. באיור 2. . כימית סכמטית המרה ניתוח של מתילציה בדנ"א כולל ארבעה שלבים עיקריים כפי שמוצג; denaturation, המרה bisulphite, הגברה PCR וניתוח. בחלונית הימנית, שינויים המולקולה ציטוסין המתרחשים במהלך ההמרה bisulphite מתוארים. באיור 3. אופטימיזציה של ה-PCR הגברה א. Agarose ג'ל אלקטרופורזה עם פרופיל שיפוע הטמפרטורה הגברה PCR מתערובת של DNA ו – 50% מפוגל unmethylated. רסיסים כבר מעוכל עם או Taq1 (T) או HpaIII (H) אשר לעכל דנ"א מפוגל ולא DNA המרה bisulphite בהתאמה. ב חום ניתוח עקומת דיסוציאציה מראה equaשיעור l של ה-DNA ואת מפוגל unmethylated (אדום לערבב קו 50/50) לעומת הגברה השליטה מפוגל מלא (קו ורוד, M) ו-DNA unmethylated (קו ירוק, U) אשר לנתק ב 82.1 ° C ו 78.9 ° C בהתאמה. איור 4. דוגמה של רצף ישיר מפה bisulphite א. רצף עקבות של שלוש שורות תאים שונים עם אתרים CPG מודגשות בצהוב. Cell קו X מציג מתילציה 100% בכל שלושת אתרי CPG בעוד שורות תאים Y ו-Z להראות בדרגות שונות של מתילציה כפי שנראה על ידי חופפים G / אותות. ב נציג bisulphite מפה המציגה את צפיפות מתילציה (נקודות אדומות) באתרים CPG בודדים, כפי שנקבע על ידי רצף ישיר של שיבוטים בודדים. <br /> איור 5. תפוקה גבוהה באמצעות ניתוח דנ"א מתילציה Sequenom א. ספקטרום להציג באמצעות טכנולוגיה Sequenom epiTYPER. שברי DNA להציג ספקטרום ספציפי, בהתאם לכמות של ההווה מתילציה בדנ"א. ב מכתם סיכום של אחוז מתילציה DNA בכל אתר CPG ארבע שורות תאים שונות. העלילה C. סיכום מתילציה נגזר מכתם Sequenom.