DNA甲基化：亚硫酸氢修改和分析

亚硫酸氢转换协议下面介绍一个标准协议为2微克的基因组DNA的转换。数额较小或较大的基因组DNA（100 PG – 200微克），也可以成功治疗的亚硫酸氢。这些反应条件，结果在完成转换几乎所有的目标DNA 序列 3（99.5-99.7％） 。 1。 DNA的制备准备通过孵化与亚硫酸氢DNA裂解液总量在37 ° C 注意：在1小时18μL（2微克吨 RNA的，280毫微克/μL蛋白酶K，1％SDS）的基因组DNA 样本：这是重要的实现最大的亚硫酸氢转换，尤其是从临床标本中，仍然有可能与DNA相关的蛋白质分离的DNA。 2。 DNA变性在20μL体积的变性2微克的DNA，2μL新鲜配制的3M NaOH溶液中加入一个最终的Concentration为0.3m。 样品在37 ° C的水浴中15分钟，随后在90℃孵育，在一个加热块2分钟。立即置于冰上5分钟管。 离心管于4 ° 10小号在10000 克 ，以确保DNA在试管底部。 3。亚硫酸氢脱氨磺化与水解脱氨 10毫米醌和饱和焦亚硫酸钠pH值5.0（7.6克钠2 S 2 O 5的10 M NaOH与464μL，15毫升水）准备新鲜的解决方案。饱和亚硫酸氢钠溶液是通过轻轻颠倒试剂/ H 2 O混合，以最小的混合和曝气。如果有必要，10米的NaOH调整pH值，充分溶解的焦亚硫酸钠注意：由于它是一个饱和溶液，小疙瘩可能仍然不溶。 新增208饱和焦亚硫酸钠和12μL变性的DNA（20μL）为10mm醌在240μL至终浓度为2.31M bisulphite/0.5mM醌，pH值5.0的最终体积，μL。轻轻混合所有试剂和离心10秒，以确保所有的水滴在试管底部。 覆盖200μL矿物油的样品。在55 ° C水浴中，为4-16小时孵育样本。亚硫酸氢处理的长度是要转换的DNA的数量和质量上的依赖。对于质量较差或降解DNA的DNA，限制孵化时间为4 小时注：重要的是，亚硫酸氢转换发生在黑暗的地方，以避免氧化，所以如果是没有可能的包装铝箔管到孵化前。 在适当的孵化时间结束，在离心旋转管简单，以确保所有的液体在试管底部。 恢复的亚硫酸氢处理的DNA仔细移液器DNA溶液从试管底部没有采取任何矿物油，从下一层油。 脱盐移除任何免费的亚硫酸氢离子通过一个脱盐柱，并在50μL（MQH 2 O）的Milli – Q水洗脱。根据基因组DNA的数量和质量上和它是如何准备的，可用于不同脱盐列。我们经常使用Promega公司向导清理列，这些列适合去除SDS编制的DNA转换之前使用。 碱Desulphonation 亚硫酸氢加合物从尿嘧啶环desulphonation。 Desulphonate 5.5μL新鲜配制的3M NaOH溶液加入到终浓度为0.3m，然后在37 ° C，持续15分钟的孵育样品。 短暂离心，并添加1μL 的 T RNA（10毫克/毫升） 。 <李>中增加33μL醋酸铵（NH 4 O AC），pH值7.0的3M公司的终浓度的解决方案。 乙醇沉淀，加入冰冷的100％的乙醇330μL的DNA，拌匀反转。 -20μC离开1小时至过夜。在15分钟的14000克离心4 ° C 。清除所有痕迹上清，空气干燥〜20分钟沉淀DNA。 暂停0.1 TE（10毫米的Tris – HCl，0.1mm的EDTA，pH值8.0）或H 2 O 50μL/微克DNA沉淀在室温下放置约2小时。偶尔涡管，以确保DNA溶解，快速离心机。 立即用于PCR扩增，或在-20 ° C存储的DNA的数量和质量而定为1-10年。 4。 PCR扩增引物设计 PCR亚硫酸氢转换特异引物的有效设计crucia为确保高效，公正完全转化的DNA扩增升发生。以下准则用于帮助引物设计。 引物设计准则 Thermocyling 要测试比例的甲基化和甲基化DNA的PCR扩增，使用一个甲基/甲基化50:50全亚硫酸氢转换控制样品和扩增的亚硫酸氢转换特定引物下，优化PCR反应条件（图3）。 50:50的甲基化：甲基化控制，使用体外 SSSI甲基化的DNA，要么全基因组扩增（WGA）的DNA或全血DNA。请注意，有些基因会自然血液中的甲基化，因此在这些情况下，最好是只使用WGA“甲基化”控制DNA。 准备PCR扩增反应混合物在100＆MU;升等份，含2μL亚硫酸氢转换的基因组DNA，200微米的dNTP的，1μM引物，1.5毫米，50 mM的氯化钾，10毫米的Tris – HCl，pH值8.3 和0.15μLTaq聚合酶MgCl 2的。 在温度梯度热循环仪，设置在一个渐变的运行反应+ / – 3 ° C，从预测的Tm的引物在10个管为了测试，甲基化和甲基化扩增产物已按比例放大，扩增被消化信息的限制性内切酶， 如Taq酶1（TCGA），将消化甲基化的DNA，但不会消化甲基化的DNA限制性内切酶网站时改变后的亚硫酸氢转换到TTGA。消化的程度，可以通过琼脂糖凝胶电泳（图3A）可视化。另外，SYBRGreen（1:1000稀释液0.2）可添加到PCR反应和甲基化的程度可以评估在实时PCR热循环仪（图3B）进行热分解图。 可能需要进行调整，以提高PCR的效率或比例，以确保甲基化和甲基化PCR片段的PCR扩增PCR反应混合物包括MgCl 2的浓度和热循环条件。 一旦PCR条件进行了优化，PCR扩增，可以进行亚硫酸氢转换样本注：一旦以旧换新优化温度梯度PCR需要不能使用。 5。代表性的成果： 亚硫酸氢盐PCR扩增优化的一个例子是如图3所示。优化PCR扩增条件应放大比例和不带偏见的甲基化和甲基化的扩增产物。图3A显示琼脂糖凝胶温度梯度PCR扩增了50％的DNA甲基化和甲基化混合物轮廓。钍经治疗后已发送PCR扩增，限制性内切酶，Taq酶1（TCGA），消化甲基化（M）的DNA，但不会消化甲基化（U）的DNA限制性内切酶的网站是由亚硫酸氢盐转化为TTGA改变。切割和未切割的PCR产物等量预计，如果DNA甲基化和甲基化比例放大。可以看出，这种凝胶，非偏置放大的最佳thermocyling条件是在56.1 ° C（T）。也可以完成转换的亚硫酸氢DNA进行分析与HPA三（CCGG）胞嘧啶网站，如特定的酶消化。 帕安 III只会消化，如果转换失败，限制站点将保持不变。如果在转换完成的限制，现场将被转换TCGG或TTGG根据的DNA甲基化状态。完整的亚硫酸氢DNA的转换，可以看出，在图3A（高）。 图3b显示实时解离积也可以用来作为一种工具，以确定是否有是基于不同的分子离解时的温度的任何扩音偏置。在这个数字中可以看出的PCR扩增甲基化（M）和甲基化（U）的DNA中的比例从50％的DNA甲基化和甲基化混合比控制完全甲基化和甲基化的DNA扩增，其中游离在82.1μC 78.9μC分别。 经过thermocyling和反应条件的优化亚硫酸氢处理的样品可以与钢绞线的具体和亚硫酸氢在单个或半巢式PCR反应的特异性引物扩增。由此产生的PCR片段可以可视化琼脂糖凝胶电泳和直接（图4A）或通过克隆和测序测序。克隆和测序单个分子的甲基化状态后，可以在亚硫酸氢地图（图4B），表格，可视化的异质性甲基化。 高通量定量甲基化分析，可以预制使用Sequenom公司EpiTYPER方法利用技术等。使用这种方法，亚硫酸氢转换的DNA与亚硫酸氢特异性PCR引物扩增和proprietry裂解过程。产生的碎片是依赖于甲基化的胞嘧啶（图5A）的存在与特定的频谱用MALDI – TOF质谱定量分析。样本中的甲基化比率的摘要，然后可以推断警句（图5B）或甲基化曲线（图5C）的形式。 图1。在正常细胞的甲基化的CpG原理图，促进相关的主要是甲基化CpG岛（灰色），而稀疏，一般甲基化（红色）的CpG位点基因机构内。在右侧面板扩展的分子结构茜在个别CpG位点的DNA，并显示在5碳的胞嘧啶甲基分子的甲基化。 图2。化学转化原理的DNA甲基化分析包括四个主要阶段，如下所示;变性，亚硫酸氢盐转化，PCR扩增和分析。在右侧面板中，修改胞嘧啶分子，亚硫酸氢转换过程中出现的描绘。 图3。优化PCR扩增：A.琼脂糖凝胶电泳，温度梯度PCR扩增了50％的DNA甲基化和甲基化混合物轮廓。要么Taq1（T）或HpaIII（H）分别消化的DNA甲基化和非亚硫酸氢转换的DNA片段已被消化。 B.热解离曲线分析显示了一个方程L的DNA甲基化和甲基化（红线50/50混合）的比例相比，完全甲基化的控制放大（粉红线，M）和甲基化DNA（绿线，U）为82.1游离于° C和78.9 ° C分别。 图4。直接测序的例子和亚硫酸氢地图 。从三个不同的细胞系，以黄色突出显示的CpG位点的序列跟踪。细胞系X显示100％，在所有3个CpG位点的甲基化，而细胞系的Y和Z显示的甲基化程度不同，重叠G / A的信号。 B.代表亚硫酸氢地图显示在个别CpG位点甲基化的密度（红点），由单个克隆直接测序确定。 <bR /> 图5。高通量DNA甲基化分析Sequenom公司。A。频谱视图使用Sequenom公司epiTYPER技术。 DNA片段显示特定的光谱，DNA甲基化目前量而定。 B.警句汇总在四个不同的细胞系的每个CpG位点的DNA甲基化的比例。 C.甲基剧情梗概来自Sequenom公司警句。