Cuantificación y análisis de la formación de HO-endonucleasa Estimulado translocaciones cromosómicas por un solo capítulo recocido en Saccharomyces cerevisiae</em

1. HO-estimulado las frecuencias de desplazamiento Inocular 10-20 independientes 1 ml de cultivos de YPGly / Lac medio (1% extracto de levadura, 2% de peptona, 3% de glicerol y 3% de lactato), con colonias aisladas del genotipo deseado. Incubar los cultivos de una noche, o durante el tiempo suficiente para llegar a una densidad celular de aproximadamente 5×10 7 1×10 8 células / ml, a 30 ° C en un rotor, o con una suave agitación. Añadir galactosa a las culturas a una concentración final de 2% para inducir HO endonucleasa dirigida DSBs en el his3-Δ3 (cromosoma III) y his3 Δ5-'(cromosoma XV) sustratos translocación. Se incuba durante 4 horas a 30 ° C en un rotor, o con una suave agitación. Después de 4 h, diluciones placa adecuada de los cultivos en YPD (1% extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa) para producir entre 100 y 200 colonias por placa, y un número suficiente de células en medio carente de histidina para producir un observable Su número de colonias + recombinante. Incubar las placas a 30 ° C durante dos o tres días. NOTA: El paso 1.4 describe la determinación de las frecuencias de desplazamiento bajo condiciones selectivas mediante siembra de los cultivos en medio carecen de histidina. Este ensayo también puede llevarse a cabo bajo condiciones no selectivas mediante siembra de cultivos en YPD, y luego replica-recubrimiento de las colonias que surgen en sus placas, dos o tres días más tarde. Estos métodos producen con frecuencias similares de translocación (Figura 2C). Determinar la frecuencia de translocaciones dividiendo el número de colonias prototróficas histidina por el número total de células viables en placas (determinado por diluciones en placas de YPD). Determinar la frecuencia de translocaciones mediana y el 95% intervalo de confianza 15. 2. La eficiencia de chapado Quitar una parte alícuota de las células de cada cultivo de una noche, y determinar el número de células por hemocitómetro cuenta (Baxter Healthcare Corporation Catolog #:. B3178-1). Placa de 100 a 200 células por medio de una dilución adecuada en YPD. Se incuba durante dos o tres días a 30 ° C (por ejemplo, para una cultura con una densidad celular de 1×10 8 células / ml, se debe placa 100-200 l de una dilución de 5.10 por placa). Agregar 20% de galactosa a las culturas a una concentración final de 2%. Después de 4 horas, retirar una alícuota de células de cada cultura, determinar el número de células, en número, hemocitómetro, y la placa de 100 a 200 células por medio de una dilución adecuada en YPD. Se incuba durante dos o tres días a 30 ° C. Determinar la eficiencia de plaqueo de dividir el número de colonias que aparecen en YPD por el número de células sembradas, y multiplicando este cociente por 100. Determinar el porcentaje de la mediana con un intervalo de confianza del 95%. 3. El análisis genómico por Southern blot Seleccione una sola colonia + Su recombinante de cada ensayo independiente y preparar el ADN genómico 16. Compendio de aproximadamente 4 g de ADN con la endonucleasa de restricción BamHI. Separados BamHI digerido fragmentos en un 0,7% en gel de agarosa y transferencia a una membrana de nylon con carga positiva (Hybond N +, GE Healthcare Código de producto:. RPN303B) 17. Hibridar con un 32 P-etiquetados sonda obtenida mediante cebado aleatorio (Amersham Biosciences Código de producto:. RPN1604) con un 1,8 kb BamHI / BamHI clon genómico que contiene el gen HIS3. Visualizar los fragmentos de ADN por autorradiografía o phosphorimaging. 4. Análisis de los cromosomas blot utilizando cromosomas separados en un contorno de los enganches de campo eléctrico homogéneo (CHEF): Preparar los cromosomas de una selección de sus recombinantes + en tapones de agarosa 18: Crecer un cultivo líquido de la válvula de expansión + Su candidato:: III cromosoma recombinante que contiene en 5 ml de YPD a aproximadamente 2.1 x 10 8 células / ml. Decantar y lavar las células dos veces con 50 mM EDTA. Resuspender las células en unos 200 l de 50 mM EDTA, y caliente a 50 ° C. Añadir un volumen igual de líquido al 2% (w / v) de agarosa de baja fusión llevado a 50 ° C, mezclar bien. Prescindir de aproximadamente el 80 alícuotas en los moldes tapón y dejar que se enfríe durante 30 minutos a 4 ° C. Extrusión enchufes del molde en un plato de 12 pocillos. Hasta cinco tapones se pueden colocar en cada pocillo. Añadir 3 ml de solución recién preparada spheroplasting (14 mM 2-β-mercaptoetanol, 20 mM EDTA, 0,5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M sorbitol) a cada pocillo. Se incuba a 37 ° C durante 4 horas con agitación suave. Retire la solución spheroplasting y reemplazar con 3 ml de solución de LDS (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 1% (w / v) de litio de dodecilsulfato, ajust pH de 8,0). Se incuba a 37 ° C durante 15 min con agitación suave. Retire la solución LDS y sustituirla por otra parte alícuota de 3 ml de LDS. Se incuba a 37 ° C durante la noche con agitación suave. Quitar LDS y reemplazar con 3 ml de 0,2 X NDS (0,6 g Tris base, 93 g de EDTA disódico dihidrato, 5 g de N-lauroilsarcosina, ajustar el pH a 8.0, llevado a 500 ml con dH 2 O). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min con agitación suave. Quitar NDS, y repetir dos veces. Quitar NDS y reemplazar con 3 ml de TE. Lavar con agitación suave durante 30 minutos a temperatura ambiente. Repetir 4 veces. Tienda de tapones a 4 ° C en 2 ml de TE. Los enchufes pueden mantener hasta por un año. Los cromosomas se separan en un 1% en gel de agarosa utilizando un Bio-Rad CHEF-DRII aparato a 14 ° C (Catálogo #: 170 a 3612). Parámetros: 1 º Bloque: tiempo de cambiar 70, 15h en 6V/cm. 2 º Bloque: tiempo de cambio de 120, de 11h a 6V/cm Visualizar los cromosomas por tinción con bromuro de etidio 1μg/ml durante 30 minutos, la irradiación con 60 mJ de la radiación UV en un Stratalinker UV (Stratagene), y de la tinción durante 30 minutos en dH 2 O. La irradiación de bromuro de etidio cromosomas teñidos nicks el ADN para permitir la transferencia eficaz de la membrana. La transferencia de cromosomas de una membrana con carga positiva (Hybond N +, GE Healthcare Código de producto:. RPN303B) por la acción capilar en condiciones de desnaturalización (NaOH 0.4N, 1,5 M NaCl). Hibridar con un 32 P-etiquetados sonda obtenida mediante cebado aleatorio (Amersham Biosciences Código de producto:. RPN1604) con un clon genómico de 1,8 kb BamHI / BamHI que contiene el gen HIS3 17. Visualizar los cromosomas por autorradiografía o phosphorimaging. 5. Los resultados representativos: Una representación gráfica de la prueba de desplazamiento se representa en el nivel de los cromosomas (Figura 1). Un esquema del procedimiento experimental también se muestra (Figura 2). Tanto antes como después de la inducción, la eficiencia de placas se determina dividiendo el número total de células viables de la colonia, formando por el número total de cuerpos celulares en la cultura determinada por hemocitómetro cuenta (Figura 4). Pre-y post-inducción de la eficiencia de la galvanización no fueron significativamente diferentes de células de tipo salvaje (p-valor = 0,1400) (Tabla 1). Tabla 1. Pre-y post-inducción de la eficiencia de la siembra en células de tipo salvaje. a El número de cuerpos de células por mililitro se determinan por el número hemocitómetro. b El número de células viables por mililitro se determinó mediante siembra de diluciones adecuadas en un medio no selectivo para producir ~ 100-200 colonias. c El pre-y post-inducción de la eficiencia de placas se determina dividiendo el número total de viables, formadoras de colonias, las células por el número total de cuerpos celulares en la cultura, determinada por el número hemocitómetro. Esto sugiere que la presencia o ausencia de cualquiera de cromosoma por translocación no afecta a la capacidad de sobrevivir a la formación de OSD. La frecuencia de las translocaciones cromosómicas se puede calcular dividiendo el número de colonias prototróficas histidina por el número total de células viables determinado por placas en YPD (Figura 2B). Este ensayo se puede realizar utilizando las cepas de genotipo diferente para identificar cómo la pérdida de función de la proteína afecta a la SSA (es decir, rad51Δ – / -). Determina las frecuencias de recombinación de cepas distintas se pueden graficar para comparar las diferencias en la capacidad de estas cepas para reparar el DSBs endonucleasa HO-inducida por la SSA (Figura 2C). Frecuencias translocación obtenidos con la cepa diploide de tipo salvaje en selectivo (2.2×10 -2) y no selectivos (2.17×10 -2) las condiciones no fueron estadísticamente diferentes entre sí (p-valor = 0,9131), mientras que las frecuencias de desplazamiento obtenido de forma selectiva (6.0×10 -2) y no selectiva (11.9×10 -2) con el rad51Δ – / – homocigotos fueron similares, pero estadísticamente diferente (p-valor = 0,0089). Las frecuencias obtenidas tanto de forma selectiva (p-valor = 0,0001) y no selectiva-(p-valor = 0,0002) con el · rad51 – / – homocigotos fueron estadísticamente diferentes de los obtenidos con las condiciones correspondientes a la cepa de tipo salvaje. Putativo teniendo translocación-clones pueden ser examinadas mediante transferencia genómica del Sur y los análisis cromosómicos blot (Figura 3). Para el análisis de Southern, el ADN genómico es digerido con la endonucleasa BamHI antes de la electroforesis en gel de agarosa, secante y la hibridación de un 32P-etiquetados 1.8kb HIS3 sonda para visualizar el diagnóstico de 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 kb tiii:: XV, 5 kb TXV:: III, y 8 kb his3-Δ5' fragmentos (Figura 3B.1) . Cromosomas intactos se pueden preparar, separados por CHEF (Figura 3B.2), se transfirieron al nylon y se hibridó con los 32 P-etiquetados 1,8 kb HIS3 sonda para visualizar el 1,1 Mb intacta cromosoma XV, 0,8 Mb TXV: cromosoma III translocación, 0,6 Mb tiii: cromosoma XV translocación, y 0,3 Mb intacto el cromosoma III (Figura 3B.3). Un mapa gráfico que representa espera endonucleasa BamHI digerir fragmentos de ADN genómico, y los padres y los cromosomas recombinantes, se muestra (Figura 3). Figura 1. Formación de los cromosomas de translocación por un solo capítulo recocido (SSA). 1) DSBs se crean en el his3-Δ3 y his3-Δ5 'sustratos (cromosomas XV y III, respectivamente) por la endonucleasa HO después de la adición de galactosa a los cultivos. 2) DSBs son procesadas para generar 3 'de un solo hilos en los extremos de los cromosomas rotos. 3) anneals SSA maquinaria complementaria 311 o 60 nucleótidos de cadena sencilla HIS3 secuencias formadas en cada uno de los sustratos de recombinación. No homólogas colas formadas en el recocido se eliminan mediante la digestión con endonucleasas. Complementarios cuatro aleros pb en los fragmentos restantes cromosómica formada por la endonucleasa HO-digestión también puede recocido. 4) Ligadura concluye la creación de un gen intacto HIS3 y válvula de expansión:: cromosoma III desplazamiento por la SSA. Células portadoras de este cromosoma puede ser seleccionado por su capacidad para crecer en medio carecen de histidina. La ligadura puede también generar el recíproco tiii:: cromosoma XV translocación de un mecanismo de NHEJ-como. Figura 2. Ensayo para determinar la frecuencia de la translocación de la SSA. A) Un ml YPGly / Lac culturas son inoculados con colonias aisladas de las células de un genotipo seleccionar y crecido hasta una densidad adecuada de aproximadamente 5×10 7 1×10 8 células / ml. Galactosa se añade a una concentración final de 2% para crear DSBs en los sustratos de recombinación de los cromosomas III y XV. Para llevar a cabo el ensayo bajo condiciones selectivas, las diluciones adecuadas se hará de manera que entre 100 y 200 células se colocan en YPD y un número suficiente de células se colocan en medio carecen de histidina para producir una cantidad observable de sus colonias + recombinante. Para llevar a cabo el ensayo, sin selección, entre 100 y 200 células se colocan en YPD, crecido por dos o tres días a las colonias de una sola y luego réplica chapada en medio carecen de histidina. B) frecuencia de translocaciones se puede determinar al dividir el número de colonias que crecen en sus placas por la fracción que crecen en YPD. C) Las frecuencias de la translocación de las cepas del genotipo diferente (es decir, de tipo salvaje y rad51Δ – / -) puede ser graficada para comparar las diferencias en la capacidad de estas cepas para reparar el DSBs por la SSA. Figura 3. Determinar la eficiencia de placas. (A) una alícuota de células se ha tomado de la cultura durante la noche antes y después de la inducción del OSD, las diluciones adecuadas se hacen, seguido de un recuento hemocitómetro para determinar el número total de cuerpos de células por ml de la cultura. Diluciones apropiadas se sembraron en un medio no selectivo para determinar el número total de células viables por ml, al contar las colonias que aparecen en YPD. (B) La eficiencia de plaqueo se determina dividiendo el número total de células viables por el número total de cuerpos celulares, y multiplicando este cociente por 100. Figura 4. La detección de eventos translocación cromosómica mediante transferencia genómica del Sur y los análisis de cromosomas blot. A) La representación gráfica de los cromosomas pertinentes antes (izquierda) y después de la formación desplazamiento (derecha). Los tamaños de los padres y los cromosomas recombinantes se enumeran en los pares megabase (Mb). Los tamaños de los fragmentos de restricción que contienen secuencias relevantes generados por la digestión BamHI del ADN genómico de los padres y las cepas recombinantes, y puso de manifiesto en transferencias por hibridación con una copia 1,8 kb BamHI HIS3 genómica, se enumeran en pares de kilobases (kb). Los cromosomas no están dibujados a escala. B) Análisis físico de los supuestos teniendo translocación-clones. (1) El análisis genómico por Southern blot – El ADN genómico se recogió y se digirió con la endonucleasa de restricción BamHI, fraccionado por electroforesis en gel, blotted de nylon, y se hibridó con un 32 P-etiquetados 1,8 kb HIS3 sonda para visualizar los siguientes fragmentos: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 kb tiii:: XV, 5 kb TXV:: III, y 8 kb his3-Δ5. Carriles: a) diploide padres, b) Su + no recíprocas translocación recombinante, c) Su desplazamiento + recombinantes recíprocas. (2) geles CHEF – cromosomas intactos fueron preparados en los enchufes de agarosa, separados por el chef, teñido con bromuro de etidio y visualizados con luz ultravioleta. Carriles: Igual que el anterior. (3) manchas cromosómicas – los cromosomas separados fueron borrados de nylon y se hibridó con los 32 P-etiquetados 1,8 kb HIS3 sonda para visualizar los cromosomas: 1.1 Mb intacta cromosoma XV, 0,8 Mb TXV: cromosoma III translocación, 0,6 Mb tiii: translocación XV cromosoma, y ​​0,3 Mb intacto el cromosoma III. Carriles: Igual que el anterior.