HO - Endonuclease의 형성의 Quantitation과 분석에서 어닐링 단일 스트랜드에 의해 염색체 Translocations을 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

1. 호 – 자극 translocation 주파수 원하는 유전자형의 한 식민지와 YPGly / LAC 매체 (1 % 효모 추출물, 펩톤 2 %, 3 % 글리세롤과 3 % 젖산)의 10-20 독립적인 하나 ML 문화의 예방. ° C 회전, 또는 ​​부드러운 교반 30에서 약 5×10 1×10 7 8 셀 / ML의 세포 밀도에 도달하는 데 충분한 시간을 하룻밤, 또는 문화를 품다. his3 – Δ3 '(염색체 III)와 his3 – Δ5'(염색체 XV) translocation 기판에 호 endonuclease – 감독 DSBs를 유도하기 위해 2 %의 최종 농도 문화 갈락토 오스를 ​​추가합니다. 30 4 H에 대한 품어 ° C 회전, 또는 부드러운 선동과 함께. 네 후 H, YPD에 문화 (1 % 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 %의 덱스 트로 오스)의 플레이트 적절한 dilutions는 관찰할 수를 얻을 수 약 100-200 판 당 식민지, 그리고 세포의 충분한 수의 중간 부족한 히스티딘로를 양보하기 위해 그의 + 재조합 식민지의 개수. 30 접시를 품어 ° C 2-3일하십시오. 참고 : 단계 1.4 중간 부족한 히스티딘에 문화를 도금하여 선택적 조건 하에서 translocation 주파수의 결정에 대해 설명합니다. 이 분석은 또한 2-3일 나중에 접시 – 그의에 발생하는 식민지가 복제 – 도금 후 YPD에 문화를 도금하여 비 선택적 조건에서 실시하고 있습니다. 이러한 방법은 translocation 비슷한 주파수 (그림 2C)을 생산하고 있습니다. 도금 가능한 세포의 총 개수 (YPD에 도금 dilutions에 의해 결정)에 의해 히스티딘 prototrophic 식민지의 수를 나누어 translocation 주파수를 확인합니다. 중간 translocation 주파수와 95 % 신뢰 구간 15 결정합니다. 2. 도금 효율성 각 숙박 문화의 세포의 나누어지는를 제거하고, hemacytometer 카운트 (박스터 헬스케어 공사 Catolog #. : B3178 – 1)에서 휴대폰 번호를 확인합니다. 플레이트 약 100 YPD에 적절한 희석을 사용하여 200 세포 수 있습니다. 30 두 3 일 동안 품어 ° C (예 : 1×10 8 셀 / ML의 세포 밀도와 문화, 한 판해야 접시 당 10-5 희석의 100-200 μl). 2 %의 최종 농도 문화 20 % 갈락토 오스를 추가합니다. 4 H 후, 각 문화의 세포의 나누어지는를 제거 hemacytometer 카운트하여 휴대폰 번호를 결정하고, YPD에 적절한 희석을 사용하여 번호판 약 100-200 세포. 30 두 3 일 동안 품어 ° C. 도금 세포의 숫자로 YPD에 게재하고, 100이 지수를 곱한 콜로니의 수를 나누어 도금 효율을 확인합니다. 95 % 신뢰 구간으로 평균 비율을 결정합니다. 3. 게놈 남부 얼룩 분석 각각의 독립적인 재판으로부터 하나의 그의 + 재조합 식민지를 선택하고 게놈 DNA에게 16 준비. BamHI 제한 endonuclease와 함께 DNA의 약 4 μg을 소화. 별도의 BamHI은 0.7 % 아가로 오스 겔에 조각을 소화하고, 긍정적 – 충전 나일론 막 (Hybond N +, GE 헬스케어 제품 코드. : RPN303B)로 전송 17. HIS3 유전자를 포함하는 1.8 킬로바이트 BamHI / BamHI 게놈 클론과 함께 : 임의의 프라이밍 (RPN1604. Amersham Biosciences 제품 코드)에 의해 얻은 32 P – 라벨 프로브와 함께 잡종. autoradiography 또는 phosphorimaging로의 DNA 조각을 시각화. 4. 에서 분리된 염색체를 사용하여 염색체 얼룩 분석 윤곽 – 고정되어 균일한 전기장 (요리사) : 아가로 오스 플러그 18 선택된 그의 이상 recombinants에서 염색체 준비 : 그의 + 후보 tXV의 액체 문화를 성장 : III 약 1-2 x를 YPD 5 ML에서 재조합 염색체 함유 10 8 셀 / ML. 다운 스핀 50 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 함께 세포에게 2 번 씻는다. Resuspend 50 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 약 200 μl의 세포, 그리고 50 따뜻한 ° C. 낮은 용융 아가로 오스는 50 ° C, 철저하게 믹스를 가져온이 용융 %의 동일한 부피 (W / V)를 추가합니다. 플러그 금형에 약 80 μl aliquots을 분배하고, 그들 4 30 분 시원한 수 있습니다 ° C. 압출 성형은 12 잘 요리로 금형에서 플러그. 최대 5 플러그에 각 우물에 삽입할 수 있습니다. 각 잘하는 신선한 spheroplasting 솔루션 3 ML (2 – β – 메르 캅 토 에탄올 14 MM 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.5 MG / ML Zymolyase 20T, 10 MM 트리스 – HCL, pH를 7.5, 1 M Sorbitol) 추가합니다. ° C 4 시간 동안은 부드러운 교반과 함께 37 알을 품다. spheroplasting 솔루션을 제거하고 신분증 솔루션 (3 ML로 교체 10 MM 트리스 – HCL, pH를 8.0, 100 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % (W / V) 리튬 Dodecyl 황산, adjus8.0 t의 산도). 37 ° C 부드러운 교반과 함께 15 분 알을 품다. 신분증 솔루션을 제거하고 신분증의 다른 세 ML의 나누어지는로 바꿉니다. 부드러운 교반과 함께 ° C 하루 37 알을 품다. 신분증을 제거하고 0.2 X NDS (0.6 g 트리스베이스, 93g 나트륨 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 이수화물, 5g N – Lauroyl Sarcosine, 8.0 산도를 조정, DH 2 O 500 ML로 이동) 3 ML로 바꿉니다. 부드러운 교반 30 분 실온에서 알을 품다. NDS를 제거하고, 2 번 반복합니다. NDS를 제거 및 3 ML TE로 바꿉니다. 상온에서 30 분 부드러운 교반과 함께 씻으십시오. 4 번 반복합니다. 저장소가 4 플러그 ° C TE 2 ML 인치 플러그는 일년까지 유지할​​ 수 있습니다. 14에서 바이오 – RAD 요리사 – DRII 장치를 사용하여 1 % 아가로 오스 겔에 별도의 염색체 ° C (카탈로그 # : 170-3612). 매개 변수 : 1 일 블록 : 70 년대 스위치 시간 6V/cm에서 15h. 2 차 차단 : 120s 스위치 시간 6V/cm에서 11h UV Stratalinker (Stratagene)에 자외선 60 MJ와 irradiating 30 분 1μg/ml ethidium의 브로마이드와 얼룩에 의한 염색체를 시각화하고, DH 2 O를 30 분 드 염색법 멤브레인에 효율적으로 전송할 수 있도록 ethidium의 브로마이드 자국 염색체 닉스에게 DNA를 Irradiating. denaturing 조건에서 모세관 작용 (0.4N NaOH, 1.5M NaCl)에 의해 : 긍정 청구 멤브레인 (RPN303B. Hybond N +, GE 헬스케어 제품 코드)로 염색체를 전송합니다. HIS3 유전자 17 포함 1.8 킬로바이트 BamHI / BamHI 게놈의 복제와 함께 : 임의의 프라이밍 (RPN1604. Amersham Biosciences 제품 코드)에 의해 얻은 32 P – 라벨 프로브와 함께 잡종. autoradiography 또는 phosphorimaging하여 염색체를 시각화. 5. 대표 결과 : translocation 분석의 그래픽 표현은 염색체 수준 (그림 1)에 그려져 있습니다. 실험 절차의 구조도 (그림 2A)이 표시됩니다. 모두 사전 및 사후 유도 도금 효율성은 hemacytometer 카운트 (그림 4B)에 의해 결정 문화에 세포 기관의 총 숫자로 가능한, 콜로니 형성 세포의 총 숫자를 나눔으로써 결정됩니다. 사전 및 사후 유도 도금 효율성은 야생 형 전지 (P – 값 = 0.1400) (표 1) 크게 다르지 않아. 표 1. 사전 및 야생 형 세포에서 포스트 유도 도금 효율성. 밀리리터 당 세포 기관의 숫자는 hemacytometer 개수에 따라 결정됩니다. B 밀리리터 당 가능한 세포의 숫자는 ~ 100-200 식민지를 생산하지 않는 선택적 중간에 적절한 dilutions를 도금에 의해 결정됩니다. C 사전 및 사후 유도 도금 효율성이의 총 숫자를 나눔으로써 결정됩니다 실용적, 식민지가 형성 hemacytometer 개수에 의해 결정 문화에 세포 기관의 총 숫자로 셀. 이것은 하나의 염색체 translocation의 존재 또는 부재가 DSB 형성 살아남을 수있는 능력에 영향을 미치지 않는 것이 좋습니다. 염색체 translocations의 빈도는 YPD에 도금 (그림 2B)에 의해 결정 가능한 세포의 총 숫자로 히스티딘 prototrophic 식민지의 수를 나누어 계산하실 수 있습니다. (- / – 예 rad51Δ)이 분석은 단백질 기능의 손실이 특수 요원 어떤 영향을 주는지 확인하기 위해 서로 다른 유전자형의 변종을 사용하여 진행하실 수 있습니다. 다른 변종 결정 재조합 주파수는 다음 (그림 2C) 특수 요원으로 호 – endonuclease 유도 DSBs을 복구하려면 다음과 종자의 능력의 차이를 비교하는 그래프로 작성할 수 있습니다. translocation 주파수가 선택 얻은 동안 선택에 따라 야생 형 diploid 스트레인 (2.2×10 -2) 및 조건 (2.17×10 -2) 이외의 선택과 함께 얻은 Translocation 주파수는 (P – 값 = 0.9131) 서로 통계적으로 다르지 않아 (6.0×10 -2) 및 비 – 선택 (11.9×10 -2) rad51Δ과 함께 – / – homozygote는 비슷하지만 (P – 값 = 0.0089) 통계 달랐다. / – – 주파수 rad51 °로 선택 모두 (P – 값 = 0.0001) 및 비 – 선택 (P – 값 = 0.0002) 획득 homozygote는 야생 타입 변형으로 해당 조건을 사용하여 얻은 이들의 통계 달랐다. Putative translocation 베어링 클론은 더욱 게놈 남부 얼룩 및 염색체 얼룩 분석 (그림 3)에 의해 검사를하실 수 있습니다. 남부의 분석을 위해, 게놈 DNA는 32 blotting과 하이브 리다이 제이션, 사전 아가로 오스 겔 전기 영동에 BamHI endonuclease의와 소화조각 (그림 3B.1) 1.8kb HIS3 탐사선이 진단 0.8 킬로바이트 his3Δ200, 1.7 킬로바이트 his3 – Δ3 ': : : XV, 5킬로바이트 tXV : III, 그리고 8킬로바이트 his3 – Δ5, 4킬로바이트 때까지'을 시각화하기 위해 P – 라벨 . 그대로 염색체는 요리사 (그림 3B.2)로 구분하여 준비 나일론으로 blotted 및 32 hybridized 수있는 P – 라벨 1.8 킬로바이트 HIS3 탐사선이 1.1 MB 그대로 염색체 XV, 0.8 MB tXV 시각 : III의 translocation의 염색체, 0.6 MB의 얹혀 : XV의 translocation의 염색체, 그리고 0.3 MB 그대로 염색체 III (그림 3B.3). 그래픽지도 BamHI endonuclease – 소화가 게놈 DNA 조각, 그리고 부모와 재조합 염색체를 (그림 3A) 그려져 있습니다 예상 묘사. 그림 1. 단일 스트랜드로 translocation 염색체의 형성은 (특수 요원) 어닐링. 1) DSBs가 문화 갈락토 오스의 또한 다음과 같은 his3 – Δ3 '와 his3 – Δ5'기판 (각각 염색체 XV 및 III) 호 endonuclease에 의해에서 만들어집니다. 2) DSBs은 깨진 염색체의 끝에 3 '단일 가닥을 생성하는 처리됩니다. 3) 특수 요원 기계 anneals 보완 311 또는 재조합 기판의 각에서 형성된 60 염기 단일 좌초 HIS3 시퀀스. 소둔시 형성이 아닌 동종 꼬리는 endonuclease의 소화에 의해 제거됩니다. HO – endonuclease의 소화에 의해 형성 나머지 염색체 조각을 보완 네 BP의 overhangs도 어닐링 수 있습니다. 특수 요원에 의해 III의 translocation의 염색체 : 4) 결합이 손상 HIS3 유전자와 tXV의 생성을 마칩니다. 이 염색체를 가지고 세포 중간 부족한 히스티딘의 성장 능력에 의해 선택하실 수 있습니다. : NHEJ 같은 메커니즘을 통해 XV의 translocation의 염색체 : 내고 또한 상호 때까지 생성할 수 있습니다. 그림 2. 특수 요원으로 translocation의 빈도를 결정하는 분석.) 하나 ML YPGly / LAC 문화가 선택 유전자형의 세포 하나의 식민지로 주사하고 약 5×10 1×10 7 8 셀 / ML의 적절한 밀도로 성장하고 있습니다. 갈락토 오스는 염색체 III와 XV에 재조합 기판에 DSBs을 만드는 2 %의 최종 농도에 추가됩니다. 선택적 조건 하에서 분석을 실시하기 위해 적절한 dilutions는 약 100-200 세포 YPD에 도금하는 등 만들어집니다과 세포의 충분한 숫자는 그의 + 재조합 식민지의 관찰 번호를 양보하기 위해 중간 부족한 히스티딘에 도금입니다. 선택하지 않고 분석을 실시하기 위해 약 100-200 세포는 YPD에 도금 중간 부족한 히스티딘에 도금 하나의 식민지 후 복제에 2 ~ 3 일 동안 성장하고 있습니다. B) Translocation 주파수는 YPD에서 성장 분획하여 – 그의 접시 성장 식민지의 개수를 나눔으로써 결정하실 수 있습니다. C) 다른 유전자형 (예 야생 유형과 rad51Δ의 변종의 translocation 주파수는 – / -) 특수 요원으로 DSBs을 복구하려면 다음과 종자의 능력의 차이를 비교하는 그래프로 작성할 수 있습니다. 그림 3. 도금의 효율성을 결정. (A) 세포의 나누어지는가 하룻밤 이전 문화와 이후 DSB 유도에서 가져온 것입니다, 해당 dilutions는 문화의 ML 당 세포 기관의 총 수를 결정하는 hemacytometer 카운트 뒤에, 만들 수 있습니다. 적절한 dilutions는 YPD에 나타나는 식민지를 세어, ML 당 실용적 세포의 총 수를 결정하기 위해 비 선택적 중간에 도금입니다. (B) 도금 효율 후 세포 기관의 총 숫자로 가능한 세포의 총 수를 나누어, 100으로이 지수를 곱하여 결정됩니다. 그림 4. 게놈 남부 얼룩 및 염색체 얼룩 분석에 의한 염색체 translocation 이벤트 감지. A) 그래픽 전에 관련 염색체의 표현 (왼쪽)와 (오른쪽) translocation 형성 후. 부모와 재조합 염색체의 크기는 megabase – 쌍 (MB)로 나열됩니다. 부모와 재조합 종자의 게놈 DNA의 BamHI는 소화 과정에 의해 생성된 관련 시퀀스를 포함하는 제한 조각의 크기, 그리고 1.8 킬로바이트 BamHI HIS3 게놈 복제와 이종 교잡에 의해 blots에 대한 공개는 kilobase – 쌍 (KB)로 나열됩니다. 염색체는 규모에 그려되지 않습니다. putative translocation 베어링 클론 B) 물리적 분석. (1) 게놈 남부 얼룩 분석 – 게놈 DNA가 겔 전기 영동, blo에 의해 fractionated, BamHI 제한 endonuclease로 수집하고 소화했습니다나일론 to tted, 다음과 같은 조각 시각화하는 32 P – 라벨 1.8 킬로바이트 HIS3 프로브 hybridized : 0.8 킬로바이트 his3Δ200, 1.7 킬로바이트 his3 – Δ3 '4킬로바이트 때까지 : XV, 5킬로바이트 tXV : III, 그리고 8킬로바이트를 his3 – Δ5. 레인 : 재조합) 부모 diploid, B) 그의 재조합 + 비 상호 translocation, C) 그의 + 상호 translocation. (2) 요리사 젤 – 손상 염색체는 ethidium의 브로마이드 물들일, 요리사로 구분하여, 아가로 오스 플러그의 준비와 자외선 아래에서 시각되었습니다. 레인 : 위에서. (3) 염색체 blots – 분리된 염색체는 나일론으로 blotted 다음과 같은 염색체 시각화하는 32 P – 라벨 1.8 킬로바이트 HIS3 프로브와 hybridized되었습니다 : 1.1 MB 그대로 염색체 XV, 0.8 MB tXV : III의 translocation의 염색체, 0.6 MB 때까지 : XV의 translocation을 염색체, 그리고 0.3 MB 그대로 염색체 III. 레인 : 위에서.