Quantificazione e analisi della formazione di HO-endonucleasi Stimolato traslocazioni cromosomiche da Single-Strand Ricottura in Saccharomyces cerevisiae</em

1. HO-stimolato traslocazione frequenze Inoculare 10-20 culture indipendenti 1 ml di YPGly / Lac media (1 estratto di lievito%, 2% peptone, 3% glicerolo e lattato 3%) con singole colonie del genotipo desiderato. Incubare le culture durante la notte, o per il tempo sufficiente a raggiungere una densità cellulare di circa 7-5×10 1×10 8 cellule / ml, a 30 ° C su un rotore, o con agitazione. Aggiungi galattosio alle culture ad una concentrazione finale del 2% per indurre HO endonucleasi-diretto presso il DSB his3-Δ3 '(cromosoma III) e his3-Δ5' (cromosoma XV) substrati traslocazione. Incubare per 4 ore a 30 ° C su un rotore, o con agitazione. Dopo 4 h, diluizioni appropriato delle culture su YPD (1 estratto di lievito%, 2% peptone, 2% di destrosio) per produrre circa 100 a 200 colonie per piastra, e un numero sufficiente di cellule su istidina medio manca di produrre un osservabile Il suo numero di colonie + ricombinante. Incubare le piastre a 30 ° C per 2-3 giorni. NOTA: Passo 1,4 descrive la determinazione delle frequenze traslocazione in condizioni di placcatura selettiva delle culture su terreno istidina carente. Questa analisi può anche essere condotto sotto non selettivi condizioni di placcatura culture su YPD, e poi replica-plating le colonie che sorgono sul suo piastre-due-tre giorni dopo. Questi metodi producono frequenze simili di traslocazione (Figura 2C). Determinare la frequenza traslocazione dividendo il numero di colonie prototrophic istidina per il numero totale di cellule vitali placcato (determinato da diluizioni placcatura in YPD). Determinare la frequenza mediana traslocazione e il 95% intervallo di confidenza 15. 2. Placcatura efficienze Rimozione di una aliquota di cellule da ogni cultura un giorno all'altro, e di determinare il numero di cellulare da emocitometro conteggio (Baxter Healthcare Corporation del catalogo #:. B3178-1). Piastra di circa 100 a 200 cellule utilizzando una diluizione appropriata sul YPD. Incubare per 2-3 giorni a 30 ° C (es. Per una cultura con una densità cellulare di 1×10 8 cellule / ml, si dovrebbe piatto 100-200 ml di una diluizione 10-5 per piastra). Aggiungere 20% galattosio alle culture ad una concentrazione finale del 2%. Dopo 4 ore, rimuovere un aliquota di cellule da ogni cultura, determinare il numero delle cellule dal conte emocitometro, e la piastra di circa 100 a 200 cellule utilizzando una diluizione appropriata sul YPD. Incubare per 2-3 giorni a 30 ° C. Determinare l'efficienza placcatura dividendo il numero di colonie che appaiono sul YPD per il numero di cellule placcato, e moltiplicando questo quoziente per 100. Determinare la percentuale media con un intervallo di confidenza al 95%. 3. Genomica Southern blot Selezionare una singola sua colonia ricombinante + indipendente da ogni prova e prepararsi DNA genomico 16. Digest circa 4 mg di DNA con endonucleasi di restrizione BamHI. Separare BamHI digerito frammenti su un 0,7% gel, e trasferimento in una membrana di nylon carica positiva (Hybond N +, GE Healthcare Codice prodotto:. RPN303B) 17. Ibridare con un P-32 etichettata sonda ottenuto da innesco casuale (Amersham Biosciences Codice prodotto:. RPN1604) con 1,8 kb BamHI / BamHI clone genomico contenente il gene HIS3. Visualizza frammenti di DNA mediante autoradiografia o phosphorimaging. 4. Blot analisi cromosomica con cromosomi separati in un profilo-bloccato omogenea campo elettrico (CHEF): Preparare cromosomi scelto Sua ricombinanti + in spine agarosio 18: Crescere una cultura liquido del suo candidato + TXV:: III cromosoma contenenti ricombinante in 5 ml di YPD a circa 1-2 x 10 8 cellule / ml. Spin down e lavare le cellule 2 volte con 50 mM EDTA. Risospendere le cellule in circa 200 ml di 50 mM EDTA, e calda a 50 ° C. Aggiungere un uguale volume di fuso 2% (w / v) bassa temperatura di fusione agarosio portato a 50 ° C, mescolare accuratamente. Erogare circa 80 microlitri aliquote in stampi spina e lasciare raffreddare per 30 minuti a 4 ° C. Estrudere prese dallo stampo in un 12-ben piatto. Fino a cinque spine può essere collocato in ciascun pozzetto. Aggiungere 3 ml di soluzione preparata spheroplasting (14 mM 2-β-mercaptoetanolo, 20 mM EDTA, 0,5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 Sorbitolo M) in ciascun pozzetto. Incubare a 37 ° C per 4 ore con agitazione. Rimuovere la soluzione spheroplasting e sostituire con 3 ml di soluzione LDS (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 1% (w / v) al litio solfato Dodecyl, adjust pH a 8,0). Incubare a 37 ° C per 15 min con agitazione. Rimuovere la soluzione LDS e sostituirla con un'altra aliquota 3 ml di LDS. Incubare a 37 ° C per una notte e scuotendo con cautela. Rimuovere LDS e sostituire con 3 ml di 0,2 X NDS (0,6 g di Tris base, 93 g di EDTA disodico diidrato, 5 g di N-Lauroyl Sarcosina, regolare il pH a 8,0, ha portato a 500 ml con dH 2 O). Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti con agitazione. Rimuovere NDS, e ripetere 2 volte. Rimuovere NDS e sostituire con 3 ml di TE. Lavare con leggera agitazione per 30 minuti a temperatura ambiente. Ripetere 4 volte. Conservare le spine a 4 ° C in 2 ml di TE. Spine può tenere fino a un anno. Cromosomi separati su un 1% gel utilizzando un Bio-Rad-CHEF DRII apparato a 14 ° C (Catalogo #: 170-3612). Parametri: 1 ° Blocco: interruttore '70 tempo, 15h a 6V/cm. 2 ° blocco: Interruttore orario 120s, 11h a 6V/cm Visualizza cromosomi dalla colorazione con bromuro di etidio 1μg/ml per 30 minuti, irradiando con 60 mJ di UV in un Stratalinker UV (Stratagene), e de-colorazione per 30 minuti in dH 2 O. Irradiando etidio bromuro cromosomi colorati nick il DNA per consentire l'efficiente trasferimento alla membrana. Trasferimento cromosomi di una membrana a carica positiva (Hybond N +, GE Healthcare Codice prodotto:. RPN303B) per azione capillare in condizioni di denaturazione (0.4N NaOH, 1.5M NaCl). Ibridare con un P-32 etichettata sonda ottenuto da innesco casuale (Amersham Biosciences Codice prodotto:. RPN1604) con 1,8 kb BamHI / BamHI clone genomico contenente il gene HIS3 17. Visualizza cromosomi mediante autoradiografia o phosphorimaging. 5. Rappresentante dei risultati: Una rappresentazione grafica del test traslocazione è raffigurato a livello cromosomico (Figura 1). Uno schema della procedura sperimentale è anche (Figura 2A). Sia pre-e post-induzione efficienze placcatura sono determinate dividendo il numero totale di vitali, le cellule formanti colonie per il numero totale dei corpi cellulari nella cultura determinata dalla emocitometro count (Figura 4B). Pre-e post-induzione efficienze placcatura non sono risultati significativamente differenti per le cellule wild-type (p = 0,1400) (Tabella 1). Tabella 1. Pre-e post-induzione efficienze placcatura in cellule wild-type. Il numero uno di corpi cellulari per millilitro sono determinate dal numero di emocitometro. b Il numero di cellule vitali per millilitro sono determinati dalla placcatura opportune diluizioni su terreno non selettivo per la produzione di ~ 100-200 colonie. c Le informazioni pre e post-induzione efficienze placcatura sono determinate dividendo il numero totale di vitale, formanti colonie, le cellule per il numero totale dei corpi cellulari nella cultura, determinato dal numero di emocitometro. Ciò suggerisce che la presenza o l'assenza di entrambi traslocazione cromosomica non influisce sulla capacità di sopravvivere formazione di DSB. La frequenza di traslocazioni cromosomiche può essere calcolato dividendo il numero di colonie prototrophic istidina per il numero totale di cellule vitali determinato dal piastrato su YPD (Figura 2B). Questa analisi può essere condotta utilizzando ceppi di genotipo diverso per capire come la perdita della funzione della proteina influenza SSA (cioè rad51Δ – / -). Frequenze di ricombinazione determinato in diversi ceppi possono essere rappresentati graficamente per confrontare le differenze nella capacità di questi ceppi di riparare il HO-endonucleasi DSB indotte da SSA (Figura 2C). Frequenze traslocazione ottenuti con il ceppo selvatico diploide sotto selettivo (2.2×10 -2) e non selettiva (2.17×10 -2) le condizioni non erano statisticamente differenti tra loro (p = 0,9131), mentre le frequenze traslocazione ottenuto selettivamente (6.0×10 -2) e non selettiva (11.9×10 -2) con la rad51Δ – / – omozigoti erano simili, ma statisticamente differenti (p-value = 0,0089). Le frequenze ottenuti sia selettivo (p-value = 0,0001) e non selettiva (p-value = 0,0002) con i pulsanti ° rad51 – / – omozigoti erano statisticamente differenti da quelli ottenuti utilizzando le condizioni in corrispondenza del ceppo selvatico. Putativo traslocazione portante cloni può essere ulteriormente esaminati da genomico Southern blot ed analisi cromosomica blot (Figura 3). Per l'analisi del sud, il DNA genomico viene digerito con endonucleasi BamHI prima di elettroforesi su gel di agarosio, blotting e ibridazione a 32P-etichettati 1.8kb HIS3 sonda per visualizzare la diagnostica 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 kb tIII:: XV, 5 kb TXV:: III, e 8 kb his3-Δ5' frammenti (Figura 3B.1) . Cromosomi intatti possono essere preparati, separati da CHEF (Figura 3B.2), cancellati al nylon e ibridato con il 32 P-etichettati 1,8 kb HIS3 sonda per visualizzare la 1.1 Mb intatto cromosoma XV, 0,8 Mb TXV: traslocazione cromosomica III, 0,6 Mb tIII: traslocazione cromosomica XV, e 0,3 Mb intatto cromosoma III (Figura 3B.3). Una mappa grafica raffigurante previsto endonucleasi BamHI-digerito frammenti di DNA genomico, e genitore e cromosomi ricombinanti, è raffigurato (Figura 3A). Figura 1. Formazione traslocazione dei cromosomi da single-strand annealing (SSA). 1) DSB sono creati al his3-Δ3 'e his3-Δ5' substrati (cromosomi XV e III, rispettivamente) da endonucleasi HO dopo l'aggiunta di galattosio alle culture. 2) DSB sono trattati per generare 3 'a singolo fili alle estremità dei cromosomi rotti. 3) annealing macchinari SSA 311 complementari o 60 nucleotidi a singolo filamento HIS3 sequenze formate in ciascuno dei substrati ricombinazione. Non omologhe code formate sulla ricottura vengono rimossi dalla digestione endonucleasi. Complementari quattro sovrasta bp sui frammenti rimanenti cromosomica formata da HO-endonucleasi digestione può anche temprare. 4) La legatura conclude la creazione di un gene intatto HIS3 e TXV:: traslocazione cromosomica III da SSA. Le cellule che trasportano questo cromosoma possono essere selezionati per la loro capacità di crescere su medio istidina carente. Legatura può anche generare il reciproco tIII:: traslocazione cromosomica XV NHEJ da un meccanismo simile. Figura 2. Test per determinare la frequenza di traslocazione da SSA. A) Un ml YPGly / Lac colture vengono inoculate con colonie di cellule di un genotipo selezionare e cresciuto fino a una densità appropriata di circa 7-5×10 1×10 8 cellule / ml. Galattosio viene aggiunto ad una concentrazione finale del 2% per creare DSB al substrati ricombinazione sui cromosomi III e XV. Per condurre il test in condizioni selettive, diluizioni appropriate fatta in modo che circa 100 a 200 cellule sono placcati su YPD e un numero sufficiente di cellule sono placcati su terreno privo di istidina produrre un numero osservabile della Sua colonie + ricombinante. Per condurre il test senza selezione, circa 100 a 200 cellule sono placcati su YPD, coltivate per due o tre giorni di singole colonie e poi replica placcata sul istidina media manca. B) frequenza di traslocazione può essere determinato dividendo il numero di colonie che crescono sul suo piastre per la frazione che crescono sul YPD. C) Le frequenze traslocazione di ceppi di genotipo diverso (cioè wild-type e rad51Δ – / -) può essere tracciata per confrontare le differenze nella capacità di questi ceppi per riparare i DSB da SSA. Figura 3. Determinare l'efficienza placcatura. (A) un'aliquota di cellule è preso dalla cultura durante la notte prima e dopo induzione DSB, diluizioni sono apportate appropriate, seguita da un conteggio emocitometro per determinare il numero totale dei corpi cellulari per ml di cultura. Diluizioni appropriate sono placcati su terreno non selettivo per determinare il numero totale di cellule vitali per ml, contando le colonie che appaiono sul YPD. (B) L'efficacia placcatura è quindi determinato dividendo il numero totale di cellule vitali per il numero totale dei corpi cellulari, e moltiplicando questo quoziente per 100. Figura 4. Rilevamento di eventi traslocazione cromosomica da genomico Southern blot e blot cromosoma. A) Rappresentazione grafica dei cromosomi rilevanti prima (a sinistra) e dopo (a destra) la formazione di traslocazione. Misure di genitore e cromosomi ricombinanti sono elencati nella megabase coppie (Mb). Dimensioni dei frammenti di restrizione contenenti sequenze rilevanti generate da BamHI digestione del DNA genomico da parenti ei ceppi ricombinanti, e ha rivelato su macchine da ibridazione con una kb 1,8 clone BamHI HIS3 genomico, sono elencati in kilobase coppie (kb). I cromosomi non sono in scala. B) Analisi fisica di presunti cloni di traslocazione-cuscinetto. (1) analisi genomica Southern blot – Il DNA genomico è stato raccolto e digerito con endonucleasi di restrizione BamHI, frazionato mediante elettroforesi su gel, blopreformato in nylon e ibridato a un P-32 etichettato 1,8 kb HIS3 sonda per visualizzare i seguenti frammenti: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 kb tIII:: XV, 5 kb TXV:: III, e 8 kb his3-Δ5 '. Corsie: a) diploide genitore, b) La sua + non reciproci traslocazione ricombinante, c) La sua traslocazione reciproca + ricombinante. (2) CHEF gel – cromosomi intatti sono stati preparati in spine agarosio, separati da CHEF, colorati con bromuro di etidio e visualizzati sotto raggi UV. Corsie: Come sopra. (3) macchine Cromosoma – cromosomi separati sono stati cancellati al nylon e ibridato con l'etichetta P-32 1,8 kb HIS3 sonda di visualizzare i cromosomi seguenti: 1.1 Mb intatto cromosoma XV, 0,8 Mb TXV: traslocazione cromosomica III, 0,6 Mb tIII: traslocazione XV cromosoma, e 0,3 Mb intatto cromosoma III. Corsie: Come sopra.