Assay HO-מגורה טרנסלוקציה מפקחת גדיל יחיד חישול בעקבות הקמתה של גדיל הדנ"א הכפול הפסקות בבית לוקוסים מספר דיפלואידי<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. מנגנון זה עשוי מודל rearrangements הגנום בתאים סומטיים של אאוקריוטים גבוהה בעקבות חשיפה מינונים גבוהים של קרינה מייננת.
וריאציה גנטית מתווכת לעתים קרובות על ידי rearrangements גנומית שעולות דרך האינטראקציה בין מפוזרים אלמנטים חוזרים כיום בגנום כל האיקריוטים. תהליך זה הוא מנגנון חשוב ליצירת גיוון בין ובתוך אורגניזמים 1-3. גנום האדם מורכב מרצף של כ 40% חוזרות ממוצא retrotransposon, כולל מגוון של קווים SINEs 4. אירועים Exchange בין האלמנטים האלה חוזרים יכול להוביל rearrangements הגנום, כולל טרנסלוקציות, שיכולים לשבש את המינון גנים ביטוי שיכול לגרום מחלות אוטואימוניות 5 לב וכלי דם, כמו גם סרטן בבני אדם 6-9.
חליפין בין אלמנטים חוזרים מתרחשת במגוון דרכים. חליפין בין רצפים המשתפים הומולוגיה מושלם (או כמעט מושלמת) מתרחשת על ידי תהליך הקרוי רקומבינציה הומולוגיים (HR). לעומת זאת, שאינם הומולוגיים סוף להצטרף (NHEJ) משתמשת מעט, או לא הומולוגיה ברצף לחילופי 10,11. המטרה העיקרית של משאבי אנוש, בתאים mitotic, היא לתקן הגדיל פעמיים הפסקות (DSBs) endogenously שנוצר על ידי שכפול ה-DNA סוטה ונגעים חמצוני, או על ידי חשיפה לקרינה מייננת (IR), ושאר סוכני ה-DNA אקסוגני נזק.
ב assay המתואר כאן, DSBs נוצרות בו זמנית הגובלים מצעים רקומבינציה בשני לוקוסים כרומוזומליות שונות בתאים דיפלואידי ועין מתנהלת על ידי-גלקטוז HO-endonuclease (איור 1). התיקון של כרומוזומים שבורים מייצר טרנסלוקציות כרומוזומליות ידי גדיל בודד חישול (SSA), תהליך שבו רצפים הומולוגיים סמוך קצות הכרומוזומים מחוברים קוולנטית לאחר חישול. אחת של מצעים, his3-Δ3 ", מכיל 3" מקוצץ HIS3 אלל והוא ממוקם על עותק אחד של כרומוזום XV על מוקד HIS3 הילידים. המצע השני, his3-Δ5 ", נמצא מוקד LEU2 על עותק אחד של כרומוזום השלישי, והוא מכיל 5" מקוצץ HIS3 אלל. מצעים שניהם מוקף אתר הכרה endonuclease HO כי יכול להיות ממוקד על ידי חתך HO-endonuclease. ההכרה HO endonuclease אתרים יליד מוקד MAT, על שני עותקים של כרומוזום III, נמחקו על כל הזנים. זה מונע אינטראקציה בין מצעים רקומבינציה אחרים מסתיים כרומוזום שבור מלהתערב assay. Kan-MX-המסומנים גלקטוז-ועין מתנהלת ביטוי HO קלטת endonuclease מוכנס אל מוקד TRP1 על כרומוזום IV. 311 המניות מצעים bp או 60 נ"ב של רצף HIS3 קידוד כי ניתן להשתמש על ידי המנגנון HR לתיקון על ידי SSA. תאים אלה להשתמש מצעים לתקן כרומוזומים שבורים על ידי משאבי אנוש טופס אלל שלם HIS3 ו tXV: טרנסלוקציה III כרומוזומליות שניתן שנבחרו על ידי היכולת לגדול על היסטידין בינוני חסר (איור 2 א). שכיחות טרנסלוקציה ידי HR מחושב על ידי חלוקת מספר מושבות prototrophic היסטידין שעולות על מדיום סלקטיבי במספר הכולל של תאים קיימא המתעוררות לאחר ציפוי דילולים המתאים על מדיום שאינו סלקטיבי (תרשים 2B). מגוון של מוטציות תיקון דנ"א שימשו במחקר בקרה גנטית של היווצרות טרנסלוקציה ידי SSA באמצעות מערכת זו 12-14.
מינון גבוה של קרינה מייננת להציג הסיכון הגלום של חוסר יציבות הגנום באמצעות הדור של מספר רב של DSBs 19. הגנום האיקריוטים הם גדושה רצפים חוזרים כי הם מצעים מעולה להפקת טרנסלוקציות ו rearrangements גנומית אחרים 20,21. טרנסלוקציות כרומוזומליות ידי HR הם נצפו לעתים קרובות כאשר DSBs מוצגים בין רצפים חוזרים 12,21,22. ראיות מכריעות עולה כי הרבה של חוסר יציבות גנומית הקשורים לוקמיה לימפומה וכן ניתן לייחס טרנסלוקציות כרומוזומליות, המדגיש את החשיבות של הבנה כיצד מנגנון זה מתרחש אאוקריוטים 22,23. פיתחנו מערכת בשמרים ניצני לבחינת מבנה הכרומוזומים טרנסלוקציה ידי DSB-Induced HR בין אזורים קצר הומולוגיה על כרומוזומים שונים כי הם דומים בגודלם אלמנטים חוזרים הפזורים השמרים ואת הגנום האנושי.
ב assay, המצע טרנסלוקציה של his3-Δ3 ממוקם על עותק אחד של כרומוזום XV. אלל אחרים his3 (his3-Δ200) יש המחיקה ~ 1kb של האמרגן HIS3 ואת רצף קידוד שמונע רצף זה מלשמש כתבנית לתיקון 24. המצע "his3-Δ5 נמצא מוקד LEU2 על עותק אחד של כרומוזום השלישי, עם העתק השני של כרומוזום III המכיל אלל ללא שינוי LEU2 (איור 1). גלקטוז-ועין מתנהלת ביטוי HO endonuclease קלטת המסומנים Kan-MX היה מוכנס לתוך מוקד TRP1 של כרומוזום IV (trp1: GAL-HO-Kan-MX). המצע כל טרנסלוקציה מוקף רצף HO-endonuclease הכרה שניתן ממוקד מחשוף ידי גרימת הביטוי של הגן HO באמצעות תוספת של גלקטוז למדיום. לאחר מחשוף המושרה HO-endonuclease ב-his3 Δ3 'ו his3-Δ5' מצעים, תאים ביעילות להשתמש בדרכי קצר משותף של הומולוגיה HIS3 רצף (311 נ"ב או 60 נ"ב) כדי לתקן את הכרומוזומים נשבר על ידי משאבי אנוש, יצירת כרומוזום טרנסלוקציה עם האלל HIS3 שלם 12-14,25.
בגלל חוסר תאים הורה עותק שלם של הגן HIS3, הם אינם מסוגלים לגדול על שלו בינוני. רק תאים שעברו את האירוע טרנסלוקציה ניתן לבחור עבור על היסטידין חסר בינוני. לכן, בתדירות של טרנסלוקציות כרומוזומליות יכול להיות מחושב על ידי חלוקת מספר מושבות prototrophic היסטידין במספר הכולל של תאים קיימא מצופה, נקבע על ידי ציפוי על YPD. הדנ"א הגנומי ו כרומוזומים שלם אז יכול להיות מבודד + מושבות נציג שלו, ואת הנוכחות של כרומוזום טרנסלוקציה מאומת על ידי דרום גנומי כתם מנתח כרומוזום.
ניתוח זהיר אפשרה לנו לאסוף מידע חשוב נוסף על assay 12. כתם הגנום ניתוח דרום סיפקה הוכחה שיש גזירה מוחלטת כמעט של הכרומוזומים XV ו-III לאחר 30 דקות של אינדוקציה HO-endonuclease, ולכן אין רקע משמעותי של מצעים כרומוזומליות נימול באוכלוסייה (ג'Manthey & A. Bailis, התוצאות לא פורסם). הגנום מנתח כתם הדרום של כרומוזום שלו – ניצולי מציין כי התאים מאבדים לעתים קרובות אחד, השני, או שניהם הכרומוזומים לגזור להישאר קיימא (L. לידל & A. Bailis, התוצאות לא פורסם). חשוב לציין, את יעילות ציפוי שווה ערך כמעט על המדיום הלא סלקטיבי לפני ואחרי הגיוס הביטוי של HO-endonuclease מציין כי לא כישלון לתיקון כרומוזומים שבורים, ולא כישלון כדי לשמור על הכרומוזומים טרנסלוקציה משפיע על היכולת לשרוד היווצרות DSB. בקנה אחד עם זו, tXV: כרומוזום טרנסלוקציה III הוכח להיות יציבה בתאים mitotic בהעדר הבחירה. זה הודגם על ידי גידול tXV: III המכיל recombinants + שלו הלילה הלא סלקטיבי, ציפוי מושבות אחת על הלא סלקטיבי צלחות ציפוי העתק על גבי מדיום סלקטיבית חסר היסטידין. עשר עד 70% של מושבות על הצלחות אלה הנובעים איבד את tXV: כרומוזום טרנסלוקציה III (נ Pannunzio & A. Bailis, התוצאות לא פורסם).
הכרומוזומים טרנסלוקציה שנוצר על ידי חשיפה IR בבני אדם מפגינים חוסר יציבות דומה 26. הדבר מצביע על כך היווצרות טרנסלוקציה עשוי לתרום אירועים בתחילת tumorigenesis ידי קידום אובדן heterozygosity. שנית, ניתוח גנטי מולקולרי נרחב מראים כי SSA, מנגנון יעיל obligatorily הלא שמרנית של משאבי אנוש, הוא המנגנון העיקרי של התהוות טרנסלוקציה ידי HR בעקבות יצירת סימולטני של DSBs על שני כרומוזומי 12,27,28. זהו שיתוףnsistent עם הממצא כי מנות גדולות של התוצאה IR בצפיפות של DSBs מספיק כדי ליצור הפסקות הסמוכים רצפים חוזרים רבים בגנום שמרים, שכיחות גבוהה של היווצרות טרנסלוקציה על ידי משאבי אנוש. יחד, תצפיות אלה מראים כי ההשפעה בשעור של חשיפה IR בבני אדם רשאי, בין השאר, תוצאה של תיקון של DSBs ידי מנגנון יעיל של משאבי אנוש שיוצר טרנסלוקציות, דרך חוסר היציבות הטבוע בהם, לקדם שינויים גנטיים tumorigenesis השיגור. בגלל הקרינה המשמשת לעיתים קרובות לטיפול, סרטן rearrangements הגנום הנובעות לתקן הקרינה הנגרמת DSBs עשויים לתרום לדור של סרטן משני שעולות לעתים קרובות אצל חולים. לפיכך, מודל זה עשוי לסייע לנו להשיג הבנה טובה יותר של הבסיס הגנטי המולקולרי של תגובה קלינית לטיפול חשוב IR.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מהמוסד הלאומי לבריאות המחקר Beckman המכון של העיר התקווה. ברצוננו להודות לסוקרים הערות קונסטרוקטיביות שלהם הוסיף בהירות כתב היד.