何刺激的易位检测监控以下二倍体多个位点的DNA双链断裂创造单链退火<em>酿酒酵母</em>。这种机制可能模式在高等真核生物体细胞暴露于高剂量的电离辐射的基因组重排。
遗传变异通常是介导的基因组重排,通过互动之间产生分散在每一个真核基因组中存在的重复元素。这个过程是一个用于生成之间以及生物体中的1-3的多样性的重要机制。人类基因组包含大约40%的重复序列,反转录转座子的起源,包括各种线和正弦 4 。这些重复的元素之间的交流活动可以导致基因组重排,包括易位,能够破坏基因的剂量和表达,可能导致自身免疫性疾病和心血管疾病,以及在人类癌症 6-9 。
多种方式重复元素之间的交流发生在。共享完美(或近乎完美的)的同源性的序列之间的交流出现这个过程被称为同源重组(HR)。相比之下,非同源末端连接(NHEJ)用于交换10,11很少或没有序列同源性。 ,在有丝分裂细胞,人力资源的主要目的是修复双链断裂(DSB的)所产生的异常DNA的复制和氧化损伤的内源性,或暴露于电离辐射(IR)和其他外源DNA损伤剂。
在这里描述的检测,DSB的同时创建两个不同的染色体二倍体细胞中的基因位点,由半乳糖诱导HO -内切酶(图1)接壤重组基板。修复破碎的染色体染色体易位产生单链退火(SSA)的,其中同源序列的染色体末端附近的一个过程共价键加入后退火。其中的基板,HIS3 -Δ3“,包含了3个” 截断 HIS3基因位于染色体第十五的复制在本地HIS3轨迹。第二基板,HIS3Δ5“,位于LEU2轨迹上的第三号染色体的一个副本,并包含一个5' 截断 HIS3基因。这两种基板两侧由HO HO -内切酶的切口,可用于有针对性的内切酶识别位点。何内切酶的识别位点的原生的 MAT轨迹,在第三号染色体的的两个副本,已在所有菌株中删除。这可防止复合基板和其他干扰检测破碎染色体末端之间的互动。 侃MX -标记的半乳糖诱导HO内切酶表达盒插入TRP1第四号染色体上的轨迹。基板份额311基点或60 BP HIS3编码序列,由福利金,可用于人力资源机械修理。使用这些基板的人力资源来修复破碎染色体的细胞形成一个完整的 HIS3等位基因和一个TXV:III染色体易位可以选择的能力,成长中缺乏组氨酸( 图2A) 。通过人力资源的易位的频率计算除以组氨酸prototrophic殖民地,在选择性培养基上出现的非选择性培养基( 图 2B)镀上适当稀释后产生的活菌总数。已被用于多种DNA修复突变体研究易位形成的遗传控制,使用本系统12-14 SSA。
高剂量的电离辐射,目前通过大量的DSB 的 19代的基因组不稳定的固有风险。真核基因组充斥着重复序列,产生易位和其他基因组重排 20,21的优秀基板。经常观察12,21,22的重复序列之间的介绍时,DSB的人力资源染色体易位。大量证据表明,大部分可以归结为染色体易位的白血病和淋巴瘤相关的基因组不稳定,突出重要性的认识这个机制是如何发生在真核生物中 22,23 。我们已经开发出在芽殖酵母为研究上的大小相似,分散在整个酵母和人类基因组的重复元素不同的染色体易位染色体之间的同源性短地区形成DSB诱导的HR系统。
在试验中,HIS3Δ3“易位基板位于之一第十五号染色体的复制上。其他HIS3基因(HIS3Δ200)的HIS3启动子和编码序列,以防止这个序列被用来作为模板修复24〜1KB删除。 HIS3Δ5“基板位于LEU2轨迹上的第三号染色体的一个副本,其他含有一个不变的LEU2等位基因( 图 1)与第三号染色体的的复制。一个半乳糖诱导HO的内切酶表达盒标有侃 MX插入到第四号染色体(TRP1:GAL中,何侃MX)TRP1的位点。每个易位基板两侧是由HO -内切酶识别序列,除了中期通过半乳糖诱导的何基因的表达,可用于裂解针对性。何内切酶诱导HIS3 -Δ3和HIS3Δ5“基板切割后,细胞可以有效地使用共享短HIS3序列同源性呼吸道(311 bp或60 BP)的人力资源来修复破碎的染色体,产生易位染色体一个完整的HIS3基因12-14,25。
由于母细胞缺乏HIS3基因的完整的副本,他们是无法生长,他的媒介。只有有发生易位事件中缺乏组氨酸的细胞可以选择。因此,染色体易位的频率可以计算活菌镀镀上YPD确定,总数除以组氨酸prototrophic殖民地。基因组DNA和完整的染色体,然后,可以分离出代表他的 +克隆和基因组南方和染色体杂交分析证实易位染色体的存在。
仔细分析,使我们能够收集更多的有关重要信息检测12。基因组Southern杂交分析提供了证据表明,有十五和第三号染色体的切割,HO -内切酶诱导后30分钟几乎是完整的,因此,在人口没有完整无缺的染色体基板显著的背景(G. Manthey&A。Bailis未发表的结果)。他的染色体基因组南方杂交分析–幸存者表示,细胞经常失去一个,其他的,或切割染色体,并保持活力(L.利德尔&A. Bailis,未发表的结果) 。更重要的是,几乎相当于非选择性培养基上的电镀效率表明,修复损坏的染色体既没有失败,也未能挽留易位染色体影响生存的能力DSB的形成前后诱导HO -内切酶的表达。与此相一致,TXV:三,易位染色体已被证明在没有选择的情况下,在有丝分裂细胞不稳定。这体现在越来越多TXV:三载有他的 +重组子过夜非选择性,非选择性板电镀到单菌落,和副本电镀到缺乏组氨酸的选择性培养基。 10 70%的殖民地这些板块所产生的已经失去的TXV:三易位染色体(N. Pannunzio&A. Bailis,未公布结果)。
由暴露在人体的红外产生的易位染色体表现出了类似的不稳定26。这表明,易位的形成可能有助于促进杂合性缺失在肿瘤发生的早期事件。二,广泛的遗传和分子生物学分析表明,SSA,人力资源的效率和强制性非保守的机制,是以下两条染色体12,27,28 DSB的同时创造易位形成人力资源的主要机制。这是合作nsistent的发现,在创建多个重复序列在酵母基因组中相邻的休息了双链断裂足够的密度,并通过人力资源的易位形成的高频率的红外的结果大剂量。总之,这些观察表明的红外暴露在人类可能致癌的影响,部分从人力资源的有效机制,产生易位,通过其内在的不稳定性,促进推出肿瘤发生的遗传变化的双链断裂的修复结果。因为辐射是经常被用来治疗癌症,基因组重排造成的辐射诱导的DNA双链断裂的修复可能会导致患者经常出现的继发性肿瘤的产生。因此,这种模式可以帮助我们更好地了解获得的遗传和分子基础的一个重要的临床反应IR的治疗。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由来自美国国立健康和希望之城贝克曼研究所研究院的资金支持。我们要感谢他们建设性的意见,清晰的手稿的评论。