En kvantitativ analys av insulin som uttrycker kolonibildande stamfäder

1. Differentiering av mus ES-celler till bukspottkörteln-liknande celler in vitro för att skapa förutsättning medierna (CM) för koloni-analysen Rutiner för murina ES-celler underhåll, har embryoid kropp (EB) bildning i suspension kultur, och fastsättning kultur för ytterligare differentiering tidigare beskrivits 1-3 och är inte i fokus i denna rapport. En schematisk presentation av stegen i vår differentiering protokoll visas i figur 1. För att få hög kvalitet under förutsättning av media, är det viktigt att först skapa 6-dagar gamla EB där minst 30-40% av dem med en diameter av minst 150 ìm. Den större EB bör innehålla mörka fläckar under ljusmikroskop, vilket tyder på ökad differentiering (figur 2). Val av hög kvalitet fetalt kalvserum (FCS) är avgörande för att skapa en sådan EBS. Hög kvalitet FCS partier väljas utifrån deras förmåga att stödja differentiation av EBS mot insulin 1, glukagon och amylas 2A genuttryck i de senare stadierna (dag 18-20) som upptäckts av RT-PCR-analys. Dessutom är då dag-6 EB överförts från avstängning kultur till fastsättning kultur (ca 80 till 100 EB per brunn i 6 brunnar) är det viktigt att försiktigt rotera plattorna att samla dag-6 EB i mitten av brunnarna. Av okänd anledning, manövrar som ökar cell-cell kontakter leder till bättre utveckling av pankreas-liknande celler från EBS i den efterföljande bilagan odlingsfasen. På kultur dag 13, byt media bifogade kultur (DMEM/F-12 (1:1), 15% knockout-serum ersättning, 2 mm L-glutamin, 50 U / mL penicillin, 50 mikrogram / ml streptomycin) med färska fastsättning kultur media containing10 mM nikotinamid, 0,1 nM exendin-4 och 10 ng / ml humant rekombinant Activin SSB (alla koncentrationer är slutlig). På kultur dag 16, samla in media från steg 1,1 och filtrera den genom ett 0,2 ìm polyetrarulfone membran. Från denna punkt framåt insamlade media kommer att kallas betingade medierna (CM). Alikvotera CM i 15 ml Falcon rör och förvaras vid -80 ° C fram till strax före halvfast kultur (se avsnitt 3 nedan). 2. Skaffa pankreas-liknande stamceller i en enda cell suspensionen med fluorescens aktiverad cell sorterare En knock-in murin ES cellinje, 4 betecknas som Ngn3-EGFP, där EGFP reporter genen ersätts en allel av Ngn3 locus var differentierade som tidigare beskrivits. 2 Ngn3 är en grundläggande helix-loop-helix (bHLH) som innehåller transkriptionsfaktor . uttrycks av stamceller i bukspottkörteln endokrina under utveckling 5 Dag-16 kulturer var vanligtvis sorteras för att få differentierade Ngn3-EGFP + och Ngn3-EGFP -. celler 1,2 Dissociation av differentierade celler till en enda cell suspension. Inkubera dag-16 kulturer wie 0,25% trypsin-EDTA (3 min, 37 ° C) för att lösgöra cellerna från kultur brunnar. Lägg till 10% FCS att stoppa trypsin aktivitet. Tvätta cellerna med magnesium och kalcium-fri fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller 0,1% bovint serumalbumin (BSA) och centrifugera vid 300 xg under 5 min. Avlägsna supernatanten och inkubera cellen klumpar med 4 mg / ml kollagenas B och 2000 U / mL deoxyribonukleas (DNas) Jag (30 min, 37 ° C) för att producera en enda cell suspension. Använd en 1000 mikroliter pipett att störa cellen pellets var 10 min till påskynda dissociation processen. Tvätta cellerna med PBS innehållande 0,1% BSA, och centrifugera vid 300 xg under 5 min. Avlägsna supernatanten och suspendera cellerna i PBS innehållande 0,1% BSA. Beredning av celler för sortering. Tillsätt 2 mikroliter DNase I (1 ME / ml) för varje ml cellsuspension att förhindra cell reaggregation under sorteringen. Passera enda cellsuspension genom en 40 till 70 ìm mESH att ta bort större cellaggregat. Lägg DAPI (1 mikrogram / ml slutkoncentration) till den gemensamma cellsuspension. Inhämta uppgifter flödescytometri på en cell sorterare. En MoFlo MLS (Beckman Coulter) cell sorterare har använts för denna rapport. Gating av cellpopulationer för sortering. Ngn3-EGFP + och Ngn3-EGFP – cellerna gated först med Forward Scatter vs sidospridning (Figur 3A), följt av DAPI vs sidospridning (Figur 3B), pulsbredd vs sidospridning (figur 3C), och slutligen FL1 vs auto-fluorescens (Figur 3D). Den slutliga slags port Ngn3-EGFP + celler avsiktlig förflyttning åt höger (Figur 3E, pilen) för att begränsa förorening av Ngn3-EGFP – celler under sorteringen. För negativ kontroll slussning, antingen dag-6 EB från Ngn3-EGFP ES linje eller samma scen, dag-16 kulturen från en icke-transgen linje, till exempel TL1 ES-celler (Figur 3D, till vänster), kan användas. Sortera Ngn3-EGFP + och Ngn3-EGFP <sup> – celler. 3. Plating sorteras celler till halvfast kultur Matrigel beredning. Alikvotera den Matrigel till 1 ml per rör och förvara vid -20 ° C före användning. Frysta portioner bör placeras vid 4 ° C över natten eller på is i 3 timmar att tina strax före användning. Tinas portioner måste vara på is under halvfast kultur förberedelser för att undvika resolidification. Metylcellulosa-lösning (3,3%) beredning. Metylcellulosa pulvret kan inte autoklaveras. För att få bakteriefri metylcellulosa lösning, använda rena väger båtar och autoklaveras barer rör, bägare, kolvar och annan maskinvara under beredningsprocessen. En dag innan metylcellulosa beredning av lösningar, lagra 200 ml sterilt dubbla destillerat vatten vid 4 ° C. Dessutom förbereder 500 ml 2x DMEM/F12 medier (Bered genom att lösa pulver DMEM / F-12 i fördubblades destillerat vatten) som innehåller 100 U / ml penicillin och100 mikrogram / ml streptomycin och förvara vid 4 ° C. På dagen av metylcellulosa förberedelser, 500 ml sterilt dubbla destillerat vatten till en 1000 ml glasbägare med en bit aluminiumfolie ovanpå. Koka under minst 30 minuter att rensa vattnet av luftbubblor. Placera en stor storlek omrörare (minst 3 inches i längd) till en 2000 ml glasflaska. Mått 300 ml kokande vatten och överföra den till kolven. Placera kolven på en uppståndelse platta (utan värme). Långsamt rör det varma vattnet att undvika att skapa luftbubblor. Väg 33 gram metylcellulosa pulver och mycket långsamt lägga till den i varmt vatten. Varmt vatten är nödvändigt för att väta metylcellulosa pulvret effektivt och stöd den efterföljande upplösningen i kalla temperaturer. Fortsätt att röra pulvret tills temperaturen sänks till ca 40-45 ° C. Tillsätt 200 ml kallt sterilt dubbla destillerat vatten till kylningen metylcellulosa blandningen. Omedelbartnär ska du börja se en lösning tur transparent och trögflytande, vilket indikerar att metylcellulosa löses upp i vattenfasen. Hand snurra kolven för att säkerställa att lösningen blandas ordentligt. Tillsätt 500 ml kallt 2x DMEM/F12 medier. Fortsätt att snurra för hand för att blanda. Placera kolven på en röra plattan i ett kallt rum, och sakta röra om metylcellulosa lösningen i 24-48 timmar. Alikvotera lösningen i 125 ml per lagring flaska och förvara vid -20 ° C. Ett prov bör lämnas ut i en steril petridish och placeras i 37 ° C inkubator för att testa sterilitet. Tinade metylcellulosa lösning kan förvaras i kylskåp upp till 2 månader. Konditionerat media beredning. Tina CM (se avsnitt 1) ​​strax före användning. Håll CM på is hela halvfast kultur beredning. Förbered följande tillväxtfaktorer: 1,0 M nikotinamid, 0,1 mikroM exendin-4, 10 mikrogram / ml rekombinant humant Activin βB, och 10 & Mu, g / ml VEGF-A. Förvara nikotinamid och exendin-4 vid -20 ° C och Activin βB och VEGF-A vid -80 ° C och tina dem omedelbart före användning. Alla halvfast närsubstrat komponenter bör hållas på is under plätering. Det bör noteras att tillägg av VEGF-A hittades senare inte nödvändigt för koloni bildas. 2 Fostrets kalvserum beredning. FCS bör värmeinaktiverad före användning. Inkubera FCS i 30 minuter vid 56 ° C i ett vattenbad för att inaktivera komplement proteiner. Om den ursprungliga FCS beståndet flaskan rymmer mer än 500 ml alikvot den i 125 ml flaskor. Den ökade ytan garanterar en jämn och grundlig uppvärmning av hela volymen. Låt flaskor svalna i rumstemperatur i minst 1 timme före förvaring vid -20 ° C. Tinade FCS är 0.2μm filtreras före användning. Blanda kultur komponenter med sorterade celler. Håll celler och alla halvfast media-komponenter på is under beredning vid alla tillfällen för att förhindra solidifiering avMatrigel. Alla leveranser som kommer i kontakt med Matrigel inklusive bör pipettspetsar, sprutor och nålar, vara kall. Placera dessa leveranser vid -20 ° C i minst en halvtimme före användning. Bestämma mängden celler som skall seedas per brunn i en 24-brunnar. Upp till 25.000 celler kan beläggas per 24-bra. Man skulle kunna utföra en titrering av celltäthet i första experiment för att bestämma det optimala antalet sådd cell. Lägg till kulturen komponenter till ett 5 ml polystyren rör med ett snäpplock i den ordning som beskrivs i tabell 1 (observera att cellerna läggs sist för att undvika för tidig stimulering). Tillsätt 3,3% metylcellulosa till polystyren rören första och den sorterade cellerna sista. Observera att 3,3% metylcellulosa lösning måste utarbetas och läggas till polystyren rör med en 16 ½ nål och en tillräckligt markerad graderad spruta. I allmänhet, för att korrekt mäta volymen av trögflytande lösningar, till exempel 3,3% metylcellulosa solution och den slutliga kultur blandningen, är det viktigt att aspirera någon lösning i sprutan först, och sedan omedelbart trycker lösningen ut att utvisa luften. De 3,3% metylcellulosa lösning kan värmas till rumstemperatur om det är för svårt att dra ut. Men se till att den kyls på is efter att den har droppats in i polystyren rören och före tillsats av Matrigel. Plate de halvfasta medier som innehåller sorterade celler. När du har kontrollerat locken av polystyren rör är ordentligt på plats, skaka rören med händerna energiskt och grundligt. Luftbubblor kommer att uppstå under denna process. Placera rören på is i 5 minuter eller tills de små luftbubblorna yta. Använd en 1 ml spruta med en 16 ½ eller 18 ½-nål för att aspirera innehållet. Följ råden i 3.6.2 att dra exakta volymen av trögflytande lösning utan luft i sprutor. Sakta avstå 500 ul av media i varje 24-väl. Användden låga bifogade 24-bra plattor bara. Lägg till media direkt till mitten av brunnen. Den halvfasta medier kommer automatiskt att spridas ut i brunnarna. För varje experimentella prov, är quadruplicated brunnar rutinmässigt används för att uppnå statistiskt signifikanta resultat. Endast de fyra innersta kolumner i ett horisontellt orienterade 24-brunnar används för kultur. Fyll resterande brunnar med sterilt vatten för att hjälpa befuktning av cellen som innehåller kultur. Inkubera cellerna i 37 ° C och 5% CO 2 luft. Fördröjd tillägg av tillväxtfaktorer. Det är möjligt att lägga till tillväxtfaktorer efter initiering av kulturen. Sådana manövrar kan användas för att ta itu med överlevnad effekterna av vissa tillväxtfaktorer. Tillväxtfaktor lösningar upp till 100 mikroliter per brunn kan vara droppas via en 1 ml spruta med en 26 G 3 / 8 nål och tillåts diffundera in i halvfasta medier. 4. Observation koloni bildas under ljuset microsklara Celler bör observeras omedelbart efter bordläggning för att säkerställa att enskilda celler är slumpmässigt och jämnt fördelade över hela ur brunnarna. Om de flesta av de celler eller den resulterande kolonierna är fördelade på marginalen av brunnarna, detta anger att fördela halvfasta material i brunnarna var för kraftfullt (se avsnitt 3.7.4). På grund av menisken effekten kolonin täthet vid anslutning till kulturen brunnar kan vara högre jämfört med dem som bor i centrum. Koloni nummer kvantifiering. På grund av den 3-dimensionella inslag i media, kommer kolonierna att visas vid olika tyngdpunkter. Således kan en justering av fokus för varje koloni krävas under observation av ljusmikroskop. Fäst ett nät enligt den 24-bra när man räknar för att undvika registrering av samma koloni två gånger. Ett rutnät kan erhållas genom att skära väggen av en NUNC petridish (kat. No.169558). En 10x objektivet på ett ljusmikroskop bör användas för att obsErve och räkna kolonierna. 5. Representativa resultat: Tidigare experiment har visat att från och med 2,5 x 10 5 murina R1 ES-celler (i 50 ml media totalt) kan man förvänta sig att generera ca 5000 lämplig storlek dag-6 EBS. Den Ngn3-EGFP ES-celler var mindre effektiva, 4 gånger fler celler krävs för att generera samma storlek EB för dag 6. Eftersom 25 dag-6 EB innehåller i genomsnitt 1,88 ± 0,67 x 10 5 celler, en cirka 37,6 x 10 6 celler kan erhållas från 5000 EBS. Under fastsättning kultur cellerna förväntas expandera 2,72 ± 0,32 gånger. 1 kommer därför att 5000 dag-6 EB ger cirka 100 x 10 6 dagars-16 celler före sortering. Efter gating kommer Ngn3-EGFP + celler utgör cirka 10% av den totala dag-16 cellpopulation (protokoll Text avsnitt 2.2.5 och figur 3). Exempel på photomicrographs av insulin-uttryckande kolonier från mus ES-celler visas i Figur 4. Dessa kolonier har en distinkt morfologi, små (~ 60-100 mikrometer) runda kolonier med enskilda celler i kolonierna som är små, mörka, och inte lätt reflekterande. I vår tidigare offentliggörande, avslöjade 2 realtid RT-PCR och dubbla immunofluorescerande färgning av individuellt handplockade kolonier uttryck för insulin, C-peptid och glukagon. Dessa resultat visar förmåga enda Ngn3-EGFP +-celler att differentiera till celler som innehåller minst två holme hormoner samtidigt som liknar primitiva första vågen som endokrina celler. Kolonin analys för spridda enstaka celler gör det möjligt att studera de stamceller som har förmågan att initiera proliferation och differentiering in vitro (Figur 5). Således är detta ett test som kan mäta inneboende funktion av enskilda stamceller. De stamceller som har capability att bli insulinproducerande uttrycka kolonier kallas insulin-uttryckande kolonibildande enheter (ICFUs) (Figur 5). Konsekvent till idén att Ngn3 märken endokrina stamceller i den växande bukspottskörteln, 5 Ngn3-EGFP +, men inte Ngn3-EGFP -. Celler från MES-cellerna populationer är berikad för ICFUs 2 är dock frekvensen av dessa förfäder fortfarande låg, cirka 0,1% till 0,6% av det totala Ngn3-EGFP + befolkningen isolerade från dag 16 kultur är ICFUs 2 Oavsett, en tydlig skillnad i kolonibildande effektivitet är väntat, med Ngn3-EGFP + celler högsta, följt av. försorterade celler, och sedan Ngn3-EGFP – celler. Figur 1. Tidslinje för in vitro-murina ES-celler differentiering bukspottkörteln-liknande celler. För konditionerat media (CM) generationen, murina ES CELÄr odlas i suspension med 15% FCS för de första sex dagarna med minskande doser av Monothioglycerol (6,0 x 10 -3 M för de första två dagarna och 6,0 x 10 -4 M för de följande fyra dagar) för att generera EBS. Dag-6 EBS (80 till 100 per brunn) överförs sedan till fastsättning 6-såväl maträtter som innehåller 15% knockout serum ersättare. 5% FCS kan läggas mellan dag 60 till 10 av kulturen för att påskynda kvarstad på EBS. Nikotinamid är exendin-4 och humana rekombinanta Activin βB sedan till media på kultur dag 13 (se avsnitt 1.1). Media samlas på kultur dag 16 och vid det här laget har blivit betingad medier. Dag 16 celler Därefter sorteras och pläterade i halvfast media för koloni analysen. Figur 2. Representant photomicrograph stora dag-6 embryoid organ härrör från mus embryonala stamceller. Perfekt dag-6 EB är minst 150 mikrometer i diametereter och har mörka centers (pilar). Redovisning av tidiga markörer bukspottskörteln stamceller (som PDX-1 och Sox9) ökar i dessa EBS (data inte visas). 3 Figur 3. Sortering portarna för MES-cellerna dag-16 Ngn3-EGFP uttrycka celler. (A) framåt och Side Scatter grindar, ett tecken på cellens storlek och granularitet respektive eliminera icke-cellulära skräp. (B) DAPI används för att identifiera döda celler, som kommer att färgas positivt när den exciteras vid 405-413 nm och utsläpp upptäckas med ett 450/40 filter. (C) pulsbredd, bredden på den elektroniska Forward Scatter puls, avslöjar dubbletter, som bör undanröjas innan de passerat genom aktiverad fluorescens cellen sorterare. (D) gating av EGFP (kanal FL1) jämfört autofluorescens med dag-16 celler från en kontroll föräldrars cellinje som TL1 (till vänster) tänds sant fluorescens och därmed Ngn3-EGFP <sup> + cellpopulation (högra panelen). (E) Röd pil visar manuell höger-förskjutning av EGFP + porten strax före sortering öka separation av falskt positiva celler. Händelser i båda (D) och (E) är gated baseras på regioner (R1 – R3) som visas i (AC). Figur 4. Representant mikrofotografier av insulinproducerande uttrycka kolonier i halvfast kultur. Kolonier är slumpmässigt och visas som små mörka, icke-ljus reflekterande kluster. Individuella kolonier kan sedan analyseras för gen-och proteinuttryck med RT-PCR och immunohistokemi analyser, respektive (visas ej, se video). Figur 5. En koloni analys som möjliggör funktionell och kvantitativa bedömningar av enskilda stamceller. Numrering av de resulterande kolonierna används för att beräkna frekvuency av stamceller hos den totala pläterade celler. Sammansättningen av celler i varje koloni är ett tecken på härstamning potential initiera stamceller. Med denna analys fann vi att Ngn3-EGFP + celler från mus-embryonala stamceller berikades av insulin som uttrycker kolonibildande enheter (ICFUs), progenitorceller som har möjlighet att differentieras till insulin som uttrycker kolonier. 2 Tabell 1. Halvfast Kultur Media Komponenter och beställa av Addition.