Un análisis cuantitativo de la insulina que expresan la formación de colonias de progenitores

1. La diferenciación de células madre embrionarias murinas a como de páncreas, las células in vitro para generar medios de comunicación acondicionado (CM) para el ensayo de colonia Procedimientos para el mantenimiento de células ES murinas, el cuerpo embrioides (EB) en la formación de cultivo en suspensión, y la cultura de apego a una mayor diferenciación han sido descritas previamente 1-3 y no son el foco de este informe. Una presentación esquemática de los pasos a seguir en nuestro protocolo de diferenciación se muestra en la Figura 1. Con el fin de obtener alta calidad de los medios condicionados, es importante para generar los primeros 6 días de edad EBS en los que al menos un 30-40% de ellos están con un diámetro de al menos 150 micras. Cuanto mayor sea EBS debe contener manchas oscuras bajo el microscopio óptico, lo que sugiere una mayor diferenciación (Figura 2). La selección de alta calidad de suero fetal bovino (FCS) es fundamental para generar este tipo de EBS. De alta calidad muchas FCS son seleccionados en base a su capacidad de apoyar la differentiation de EBS a la insulina 1, el glucagón y 2A amilasa expresión génica en las etapas posteriores (días 18-20) detectado por RT-PCR análisis. Además, cuando el día 6 EBs se transfieren de cultivo en suspensión a la cultura de apego (aproximadamente 80 a 100 EBs por pocillo en placas de 6 pocillos) es importante para girar suavemente las placas para recoger el EBS del día 6 en el centro de los pozos. Por razones desconocidas las maniobras, que mejoran la célula-célula resultado de los contactos en un mejor desarrollo de las células pancreáticas como la de EBS en la etapa de apego cultivo posterior. En el día de la cultura 13, sustituir el medio de cultivo adjunto (DMEM/F-12 (1:1), el 15% de sustitución por nocaut en suero, 2 mM L-glutamina, 50 U / mL de penicilina, 50 mg / ml de estreptomicina) con la cultura de apego fresco los medios de comunicación containing10 nicotinamida mM, 0,1 nM exendina-4 y 10 ng / ml humana recombinante SSB activina (todas las concentraciones son finales). En el día de la cultura 16, recogen los medios de comunicación desde el paso 1.1 y filtrar a través de un 0,2 micras poliéteresulfone membrana. De aquí en adelante los medios de comunicación recogidos se hará referencia a como los medios de comunicación condicionado (CM). Alícuota de la CM en 15 ml tubos Falcon y lo almacenan a -80 ° C hasta justo antes de la semi-sólida cultura (véase la Sección 3). 2. La obtención de páncreas-como progenitores en suspensión de células individuales usando un clasificador de células activadas por fluorescencia Un golpe en la línea murina de células ES, 4 designados como Ngn3-EGFP, donde el gen reportero EGFP reemplazado un alelo del locus Ngn3 se diferenció como se describió anteriormente. Ngn3 2 es un factor básico de transcripción hélice-lazo-hélice (bHLH) que contiene . expresadas por los progenitores durante el desarrollo del páncreas endocrino 5 días-16 cultivos fueron ordenados normalmente para obtener diferenciados Ngn3-EGFP + y Ngn3-EGFP -. células 1,2 La disociación de las células diferenciadas en una suspensión de células individuales. Incubar el día 16 culturas wiª 0,25% de tripsina-EDTA (3 min, 37 ° C) para desalojar a las células de los pozos de la cultura. Agregar 10% de FCS para detener la actividad de la tripsina. Lavar las células con el magnesio y el calcio libre de buffer fosfato salino (PBS) que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA), y centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y se incuban los grupos de células con 4 mg / ml de colagenasa B y 2000 U / mL desoxirribonucleasa (DNasa) I (30 min, 37 ° C) para producir una suspensión de células individuales. Use una pipeta de 1.000 l para interrumpir el gránulos de las células cada 10 minutos para acelerar el proceso de disociación. Lavar las células con PBS que contenía 0,1% de BSA y centrifugar a 300 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en PBS que contenía 0,1% de BSA. Preparación de las células para la clasificación. Añadir 2 l de DNasa I (1 MU / ml) por cada ml de suspensión celular para evitar reagregación de células durante la clasificación. Pase la suspensión de células individuales a través de un m m 40 a 70esh para eliminar los agregados de células grandes. Añadir DAPI (1 mg / ml concentración final) a la suspensión de células individuales. Adquirir datos de citometría de flujo en un clasificador de células. A MoFlo MLS (Beckman Coulter) clasificador celular se utilizó para este informe. Invocación de las poblaciones de células para la clasificación. Ngn3-EGFP + y Ngn3-EGFP – las células son cerradas primero con dispersión hacia adelante frente a dispersión lateral (Figura 3), seguido por DAPI versus dispersión lateral (Figura 3B), ancho de pulso frente a dispersión lateral (Figura 3C), y, finalmente, FL1 vs auto-fluorescencia (Figura 3D). La puerta último tipo de Ngn3-EGFP + células es intencionalmente mueve a la derecha (Figura 3E, flecha) con el fin de limitar la contaminación de Ngn3-EGFP – las células durante la clasificación. Para gating control negativo, ya sea de día-6 EBs de Ngn3-EGFP línea de ES o el mismo escenario, el día 16 la cultura de una línea no transgénica, como las células ES TL1 (Figura 3D, panel izquierdo), se puede utilizar. Ordenar Ngn3-EGFP + y Ngn3-EGFP <sup> – las células. 3. Revestimiento ordenados células semi-sólida cultura Matrigel preparación. Alícuota del Matrigel a 1 ml por tubo y se almacenan a -20 ° C antes de su uso. Alícuotas congeladas deben ser colocados a 4 ° C durante la noche o el hielo durante 3 horas para descongelar antes de su uso. Alícuotas descongelado debe mantenerse en hielo durante la preparación de cultivo semi-sólido para evitar resolidificación. Solución de metilcelulosa (3,3%) la preparación. Polvo de metilcelulosa no pueden ser esterilizados en autoclave. Con el fin de obtener libre de bacterias solución de metilcelulosa, utilice agua limpia barcos de pesaje y bares autoclave revuelo, vasos, frascos y otros equipos durante el proceso de preparación. Un día antes de la preparación de la solución de metilcelulosa, almacenar 200 ml de agua estéril bidestilada a 4 ° C. Por otra parte, preparar 500 ml de 2x DMEM/F12 los medios de comunicación (preparar disolviendo polvo DMEM / F-12 de doble agua destilada), que contiene 100 U / ml de penicilina y100 mg / ml de estreptomicina y almacenar a 4 ° C. En el día de la preparación de metilcelulosa, añadir 500 ml de agua destilada estéril doble a un vaso de vidrio de 1000 ml con un pedazo de papel de aluminio en la parte superior. Hierva el agua por al menos 30 minutos para eliminar el agua de burbujas de aire. Coloque una barra de gran revuelo tamaño (al menos 3 pulgadas de largo) en un matraz de vidrio de 2000 ml. Medir 300 ml de agua hirviendo y transferirlo al matraz. Colocar el matraz en una placa de agitación (sin calefacción). Revuelva lentamente el agua caliente para evitar la generación de burbujas de aire. Pesar 33 gramos de polvo de metilcelulosa y muy lentamente se añade al agua caliente. El agua caliente es necesario humedecer el polvo de metilcelulosa de manera eficiente y ayudar a la posterior disolución de la temperatura fría. Continúe revolviendo el polvo hasta que la temperatura se reduce a aproximadamente 40-45 º C. Añadir 200 ml de la fría agua destilada estéril doble a la mezcla de metil-enfriamiento. Inmediatamentedespués, usted debe comenzar a ver la solución a su vez transparente y viscoso, lo que indica que la metilcelulosa se disuelve en la fase acuosa. Remolino de la mano del matraz para que la solución se mezcla a fondo. Añadir 500 ml de la fría 2x DMEM/F12 los medios de comunicación. Continuar a girar con la mano para mezclar. Colocar el matraz en una placa de agitación en una habitación fría, y revuelva lentamente la solución de metilcelulosa durante 24-48 horas. Alícuota de la solución en 125 ml por botella de almacenamiento, y guardar a -20 ° C. Una muestra debe ser dispensado en un petridish estéril y se coloca en 37 ° C incubadora para prueba de esterilidad. Solución descongelada metilcelulosa puede guardarse en el refrigerador hasta por 2 meses. Preparación de medios condicionados. CM deshielo (ver sección 1) justo antes de su uso. Mantenga la CM en el hielo durante la preparación de cultivo semi-sólido. Prepare los factores de crecimiento: 1,0 M nicotinamida, 0,1 M exendina-4, 10 mg / ml humana recombinante βB activina, y 10 y mu, g / mL de VEGF-A. Guarde la nicotinamida y la exendina-4 a -20 ° C y la activina βB y VEGF-A a -80 ° C, y descongelar inmediatamente antes de su uso. Todos los medios semisólidos cultura componentes deben ser mantenidas en hielo durante el recubrimiento. Cabe señalar que la adición de VEGF-A se encontró más tarde no es necesario para la formación de colonias. 2 Preparación de suero de ternera fetal. FCS debe ser inactivado por calor antes de su uso. Incubar el FCS durante 30 minutos a 56 ° C en un baño de agua para inactivar las proteínas del complemento. Si la primera botella de FCS archivo contiene más de 500 ml alícuotas que en 125 ml viales. El aumento de superficie se asegurará de calentamiento uniforme y completa de todo el volumen. Permita que los frascos se enfríen a temperatura ambiente durante al menos 1 hora antes de guardar a -20 ° C. Descongelado FCS es 0.2μm filtrada antes de su uso. Mezcle los componentes cultivo con células ordenados. Mantener las células y todos los componentes semi-sólido en el hielo durante la preparación en todo momento para evitar la solidificación deMatrigel. Todos los suministros que entran en contacto con la inclusión de Matrigel, puntas de pipeta, jeringas y agujas, debe estar fría. Lugar estos suministros a -20 ° C por lo menos media hora antes de su uso. Determinar la cantidad de células que se sembradas por pocillo en una placa de 24 pocillos. Hasta 25.000 células puede ser plateado por 24 pozos. Se podría realizar una valoración de la densidad celular en los primeros experimentos para determinar el número óptimo de siembra de células. Agregar los componentes de la cultura de un tubo de poliestireno de 5 ml con una tapa de presión en la secuencia que se describe en la Tabla 1 (tenga en cuenta que las células se añade al final para evitar el prematuro estimulación). Agregar la metilcelulosa 3,3% a los tubos de poliestireno primera y la última de las células ordenados. Tenga en cuenta que la solución de metilcelulosa 3,3% tiene que ser elaborado y se añade a los tubos de poliestireno con una aguja de calibre 16 ½ y una jeringa graduada adecuadamente marcados. En general, con el fin de medir correctamente el volumen de soluciones viscosas, como el 3,3% de metilcelulosa sollución y la mezcla de la cultura final, es importante para aspirar una solución en la jeringa, y luego inmediatamente pulsar la solución a expulsar el aire. La solución de metilcelulosa al 3,3% puede ser calentado a la temperatura ambiente, si es demasiado difícil de extraer. Sin embargo, asegúrese de que se enfría en hielo después de que se dispensa en los tubos de poliestireno y antes de la adición de Matrigel. Placa de los medios semi-sólidos que contienen las células ordenados. Después de asegurar las tapas de los tubos de poliestireno están firmemente en su lugar, agitar los tubos vigorosamente las manos y en profundidad. Las burbujas de aire se genera durante el proceso. Coloque los tubos en hielo durante 5 minutos o hasta que el aire pequeñas burbujas de la superficie. Se utiliza una jeringa de 1 ml con un 16 ½ y 18 ½, calibre de la aguja para aspirar el contenido. Siga los consejos de 3.6.2 a dibujar el volumen exacto de solución viscosa sin aire en las jeringas. Poco a poco prescindir de 500 l de los medios de comunicación en cada uno de 24 pocillos. Usoel poco apego placas de 24 pocillos solamente. Añadir los medios de comunicación directamente al centro del pozo. Los medios semi-sólidos de forma automática hacia fuera en los pozos. Para cada muestra experimental, pozos cuadruplicado se utilizan habitualmente para obtener resultados estadísticamente significativos. Sólo el 4 columnas más interior de una orientación horizontal de 24 pocillos de placas se utiliza para el cultivo. Llenar los pozos restantes con agua estéril para ayudar a la humidificación del cultivo de células que contienen. Se incuban las células a 37 ° C CO 2 y el 5% de aire. Retraso en la adición de factores de crecimiento. Es posible agregar factores de crecimiento después de la iniciación de la cultura. Tales maniobras se pueden utilizar para hacer frente a los efectos de la supervivencia de ciertos factores de crecimiento. Soluciones de factor de crecimiento de hasta 100 l por pocillo puede gotear a través de una jeringa de 1 ml con una G 26 3 / 8 y aguja les permite difundir en los medios semi-sólidos. 4. Observando la formación de colonias en los micros de luzhacer frente a Las células deben ser observados inmediatamente después de la siembra para asegurar que las células individuales de forma aleatoria y uniformemente distribuidas a lo largo de los pozos. Si la mayoría de las células o las colonias resultantes se distribuyen al margen de los pozos, esto indicará que la supresión de los medios semi-sólidos en los pozos era demasiado fuerte (ver sección 3.7.4). Debido a la densidad del menisco colonia efecto en los márgenes de los pozos de la cultura puede ser más alta en comparación con aquellos que residen en el centro. Colonia cuantificación numérica. Debido a la función de tres dimensiones de los medios de comunicación, las colonias que aparecen en diferentes puntos focales. Por lo tanto, un ajuste del enfoque de cada colonia puede ser necesario durante la observación al microscopio óptico. Coloque una rejilla en la de 24 y cuando se cuenta con el fin de evitar el registro de la misma colonia en dos ocasiones. Una red se puede obtener mediante la reducción de la pared de un petridish NUNC (Cat. No.169558). Una lente objetivo de 10x en un microscopio de luz debe ser utilizada para observe y el recuento de las colonias. 5. Los resultados representativos: Experimentos previos habían demostrado que a partir de 2,5 x 10 5 células murinas ES R1 (en 50 ml totales medios) se podría esperar de generar aproximadamente 5.000 raciones apropiadas para el día 6 EBS. Las células Ngn3-EGFP ES eran menos eficientes, las células 4 veces más se requiere para generar tamaño similar EBs el día 6. Debido a que 25 días-6 EBs contienen un promedio de 1,88 ± 0,67 x 10 5 células, una de aproximadamente 37,6 x 10 6 células se pueden obtener a partir de 5000 EBS. Durante el cultivo de las células archivo adjunto se prevé una expansión 2,72 ± 0,32 veces. 1 Por lo tanto, 5.000 días-6 EBs rendirá aproximadamente 100 x 10 6 16 días de las células antes de la clasificación. Después de apertura de puerta, las células Ngn3-EGFP + representará aproximadamente el 10% de la población total de días-16 células (sección 2.2.5 Protocolo de Texto y Figura 3). Ejemplo de la photomicrogrotos de la insulina que expresan colonias derivadas de células madre embrionarias murinas se muestra en la Figura 4. Estas colonias tienen una morfología característica, pequeño (60-100 micras) colonias redondas con células individuales en las colonias que son pequeños, oscuros, y no refleja la luz. En nuestra publicación anterior, 2 en tiempo real RT-PCR y la doble tinción de inmunofluorescencia de las colonias de forma individual a dedo reveló la expresión de insulina, péptido C y glucagón. Estos resultados demuestran la capacidad de un solo Ngn3-EGFP + células a diferenciarse en células que contienen al menos dos hormonas islote al mismo tiempo, se asemeja primitiva de la primera ola como las células endocrinas. El ensayo de colonias de células que quedan disgregadas solo permite el estudio de los progenitores que tienen la capacidad para iniciar la proliferación y diferenciación in vitro (Figura 5). Por lo tanto, esta es una prueba que puede medir la función intrínseca de las células progenitoras individual. Los progenitores que tienen la capabidad de convertirse en la insulina que expresan las colonias que se denomina la insulina que expresan unidades formadoras de colonias (ICFUs) (Figura 5). En consonancia con la idea de que Ngn3 marcas células endocrinas progenitoras en el páncreas en desarrollo, 5 Ngn3-EGFP +, pero no Ngn3-EGFP -. Células de economía de mercado derivadas de células poblaciones se enriquecen de la ICFUs 2 Sin embargo, la frecuencia de estos progenitores es aún bajo, aproximadamente un 0,1% a 0,6% del total de la población Ngn3-EGFP + aislados desde el día 16 la cultura son dos ICFUs pesar de todo, una clara diferencia en la formación de colonias de eficiencia que se espera, con Ngn3-EGFP + células más alto, seguido por el. células preclasificado, y el Ngn3-EGFP – las células. Figura 1. Cronología de murino in vitro ES diferenciación de las células como las células pancreáticas. Para acondicionado medios de comunicación (CM) de generación, murino cel ESls se cultivan en suspensión con un 15% de FCS para los primeros seis días con dosis decrecientes de monotioglicerol (6,0 x 10 -3 M de los dos primeros días y 6,0 x 10 -4 M para los próximos cuatro días) para generar EBS. Día-6 EBS (80-100 por pocillo) se transfieren a la conexión de 6 y platos que contienen 15% de suero de reemplazo de octavos de final. 5% de FCS se puede añadir entre los días 60-10 de la cultura para acelerar la adhesión de EBS. La nicotinamida, la exendina-4, y el recombinante humano βB activina se añaden a los medios de comunicación en el día de la cultura 13 (ver sección 1.1). En ella se recoge el día 16 y la cultura en este punto se ha convertido en un medio condicionado. El día 16 las células se ordenan y se cultivan en medios semisólidos para el ensayo de colonia. Figura 2. Microfotografía Representante de los grandes cuerpos del día 6 embrioides derivadas de células madre embrionarias murinas. Ideal el día 6 EBs son al menos 150 micras de diámetroeter y se han oscurecido los centros (flechas). La expresión de marcadores tempranos pancreáticas progenitoras (como PDX-1 y Sox9) se ha mejorado en estos 3 EBS (datos no mostrados). Figura 3. Clasificación puertas de MES de células derivadas de 16 días-Ngn3-las células que expresan EGFP. (A) las puertas de dispersión frontal y lateral, indicativo del tamaño de la celda y granularidad, respectivamente, eliminar los restos celulares no. (B) DAPI se utiliza para identificar las células muertas, que se tiñen positivas cuando se excita a 405 a 413 nm y emisión detectada con un filtro de 450/40. (C) por ancho de pulso, la anchura del pulso de dispersión frontal electrónico, revela dobletes, que deben ser eliminadas antes de pasar a través de la clasificadora de fluorescencia de células activadas. (D) de apertura de puerta de EGFP (canal FL1) frente a la autofluorescencia con 16 días de las células de una línea celular de control parental como TL1 (izquierda) se ilumina de fluorescencia y por lo tanto la verdadera Ngn3 EGFP-<sup> población celular + (panel derecho). (E) La flecha roja muestra manual de desplazamiento a la derecha de la puerta de EGFP + justo antes de la clasificación para aumentar la separación de células positivas falsas. Eventos en los dos (D) y (E) es cerrado sobre la base de las regiones (R1 – R3) se muestra en la (AC). Fotomicrografías la figura 4. Representante de la insulina que expresan las colonias en zonas semi-sólida cultura. Las colonias se distribuyen al azar y aparecen como pequeñas oscuras, la luz no grupos de reflexión. Las colonias de manera individual se puede analizar la expresión de genes y proteínas por RT-PCR y análisis de inmunohistoquímica, respectivamente (no se muestra, ver video). Figura 5. Un ensayo de colonia que permite la evaluación funcional y cuantitativo de las células progenitoras sola. Numeración de las colonias resultantes se utiliza para calcular la frecuenciauency de las células progenitoras entre las células sembradas total. La composición de las células dentro de cada colonia es un indicador del potencial del linaje de los progenitores de iniciación. El uso de este ensayo, se encontró que Ngn3-EGFP + células derivadas de células madre embrionarias murinas se enriquecieron de la insulina que expresan unidades formadoras de colonias (ICFUs), las células progenitoras que tienen la capacidad de diferenciarse en la insulina que expresan las colonias 2. Tabla 1. Semi-sólido Cultura componentes y orden de adición.