Количественный анализ на инсулиноподобный выражения колониеобразующих прародителей

1. Дифференциация мышиные клетки поджелудочной железы ES-подобных клеток в пробирке для генерации кондиционированной среде (СМ) для анализа колонии Процедуры обслуживания клетка мышиной Е.С., эмбриоидных тела (EB) образование в суспензионной культуре и привязанность культуры для дальнейшей дифференциации были описаны ранее 1-3 и не являются предметом настоящего доклада. Схематическое представление этапов нашей дифференциации протокол показано на рисунке 1. Для того чтобы получить высококачественное кондиционированной среде, важно, чтобы сначала создать 6-дневных ЭТ в которых хотя бы 30-40% из них с диаметром не менее 150 мкм. Больше ЭТ должна содержать темные пятна под световым микроскопом, предполагая расширение дифференциации (рис. 2). Выбор высокого качества эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) имеет решающее значение для создания таких EBS. Высокое качество ФТС много отбираются на основе их способности поддерживать differentiatионов ЭТ к инсулину 1, глюкагона и амилазы 2А экспрессии генов в более поздних стадиях (день 18-20), которая была определена методом ОТ-ПЦР анализа. Более того, когда день-6 ЭТ передаются из суспензионной культуры с привязанностью культуры (примерно 80 – 100 ЭТ на лунку в 6 луночных) важно, чтобы аккуратно вращать пластины для сбора день-6 ЭТ в центре скважины. По неизвестным причинам, маневры, которые повышают межклеточных контактов приведет к улучшению развития поджелудочной железы-подобных клеток из ЭТ в последующей стадии культуры привязанности. О культуре 13-й день, заменить привязанность медиакультуры (DMEM/F-12 (1:1), 15% сыворотки замены нокаутом, 2 мМ L-глутамина, 50 ЕД / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина) со свежей культурой привязанность СМИ containing10 мМ никотинамида, 0,1 нМ exendin-4 и 10 нг / мл рекомбинантного человеческого активин SSB (все концентрации являются окончательными). На 16-й день культуры, собирать средства массовой информации, начиная с шага 1.1 и процеживают через 0,2 мкм полиэфировulfone мембраны. С этого момента собранные средства массовой информации будут называться кондиционированной среде (СМ). Алиготе CM в 15 мл труб Сокол и хранить его при температуре -80 ° C до только до полутвердых культуры (см. раздел 3 ниже). 2. Получение поджелудочной железы, как прародители в суспензии отдельных клеток с использованием флуоресценции активирован сортировщик ячейки Стук в мышиной клеточной линии ES, 4 обозначается как Ngn3-EGFP, где ген EGFP репортер заменил один аллель локуса Ngn3 был дифференцирован как описано выше. Ngn3 2 является одним из основных спираль-петля-спираль (bHLH), содержащий фактор транскрипции . выраженную панкреатических эндокринных предшественников при разработке 5 дней-16 культурах, как правило, отсортированных для получения дифференцированных Ngn3-EGFP + и Ngn3-EGFP -. клеткам 1,2 Диссоциация дифференцированных клеток в суспензии отдельных клеток. Инкубируйте день-16 культур шм 0,25% трипсина-EDTA (3 мин, 37 ° C), чтобы выбить клетки от культуры скважин. Добавить 10% FCS, чтобы остановить трипсина деятельности. Вымойте клеток с магнием и кальцием без фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), а центрифуги в 300 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант и инкубировать ячейки сгустки с 4 мг / мл коллагеназы B и 2000 ЕД / мл дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) я (30 мин, 37 ° C) для получения суспензии отдельных клеток. Используйте 1000 мкл пипетки сорвать ячейки гранул каждые 10 мин, чтобы ускорить процесс диссоциации. Вымойте клеток с PBS, содержащем 0,1% БСА, а центрифуги в 300 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в PBS, содержащем 0,1% БСА. Подготовка клетки для сортировки. Добавьте 2 мкл ДНКазы I (1 МЕ / мл) на каждые мл клеточной суспензии для предотвращения ячейки реагрегация во время сортировки. Pass суспензии отдельных клеток через 40 до 70 мкм мэш для удаления крупных скоплений клеток. Добавить DAPI (1 мкг / мл, конечная концентрация) в суспензии отдельных клеток. Приобретать проточной цитометрии данные о ячейке сортировщика. MoFlo MLS (Beckman Coulter) ячейки сортировщик был использован для этого отчета. Память клеточных популяций для сортировки. Ngn3-EGFP + и Ngn3-EGFP – клетки закрытого сначала вперед по сравнению с разбросом стороны разброса (рис. 3А), а затем против DAPI стороны разброса (рис. 3В), длительность импульса по сравнению с разбросом сторону (рис. 3C) и, наконец, FL1 против авто-флуоресценции (рис. 3D). Окончательный ворот рода Ngn3-EGFP + клеток намеренно переехал в правой (рис. 3Е; стрелка) в целях ограничения загрязнения Ngn3-EGFP – клетки во время сортировки. Для отрицательных стробирования контроля, ни днем, ЭТ-6 из-Ngn3 EGFP ES линии или же стадии, день-16 культуры из не-трансгенных линий, таких как TL1 ЭС клетки (рис. 3D, левая панель), могут быть использованы. Сортировать Ngn3-EGFP + и Ngn3-EGFP <suр> – клетки. 3. Покрытие отсортированные клетки полутвердых культуры Матригель подготовки. Алиготе Матригель до 1 мл на пробирку и хранить при температуре -20 ° C до использования. Замороженные порции должны быть размещены на 4 ° С в течение ночи или на льду в течение 3 часов до оттепели непосредственно перед использованием. Талая аликвоты должны оставаться на льду во время полутвердых культуры подготовку, чтобы избежать resolidification. Метилцеллюлоза решение (3,3%) препарата. Метилцеллюлоза порошок не может быть в автоклаве. Для того чтобы получить бактерии без метилцеллюлозы решение, использовать чистую весом лодки и автоклавного баров размешать, стаканы, колбы и другие аппаратные средства во время подготовки процесса. За день до приготовления раствора метилцеллюлозы, хранить 200 мл стерильной бидистиллированной воды при 4 ° C. Кроме того, подготовить 500 мл 2 раза DMEM/F12 СМИ (подготовить путем растворения порошкообразного DMEM / F-12 в удвоилось дистиллированной воды), содержащий 100 ЕД / мл пенициллина и100 мкг / мл стрептомицина и хранить при 4 ° C. В день метилцеллюлозы подготовки, добавить 500 мл стерильной дистиллированной водой стеклянный стакан, 1000 мл с кусочком алюминиевой фольги на вершине. Варить в течение 30 мин, чтобы избавить воду воздушными пузырьками. Место большого размера мешалкой (не менее 3 дюймов в длину) в стеклянную колбу 2000 мл. Мера 300 мл кипящей воды и перенести его в колбу. Место колбу на мешалки (без отопления). Медленно перемешать горячей воды, чтобы избежать возникновения пузырьков воздуха. Взвесьте 33 г метилцеллюлозы порошка и очень медленно добавьте его в горячей воде. Горячая вода необходима для мокрой метилцеллюлозы порошок эффективно и помощь последующего растворения в холодной температуре. Продолжайте размешивать порошок, пока температура снижается примерно до 40-45 ° С. Добавить 200 мл холодной стерильной дистиллированной водой охлаждения смеси метилцеллюлозы. Немедленнопосле этого, вы должны начать видеть решение очередь прозрачной и вязкой, указывая, что метилцеллюлоза растворяется в водной фазе. Рука водоворот колбу для обеспечения решения тщательно перемешивают. Добавить 500 мл холодной 2x DMEM/F12 СМИ. Продолжайте водоворот вручную перемешать. Место колбу на мешалки в холодной комнате, и медленно перемешать раствор метилцеллюлозы в течение 24-48 часов. Алиготе раствора в 125 мл на хранение бутылки, и храните при температуре -20 ° C. Выборка должна быть разливали в стерильные petridish и помещен в 37 ° С инкубатор для тестирования стерильности. Талая метилцеллюлозы решение может храниться в холодильнике до 2 месяцев. Условные подготовка средств массовой информации. Оттепель СМ (см. раздел 1) непосредственно перед использованием. Держите CM на льду всей полутвердых культуры подготовки. Подготовьте следующие факторы роста: 1,0 М никотинамид, 0,1 мкМ exendin-4, 10 мкг / мл рекомбинантного человеческого активин βB и 10-мщ г / мл VEGF-A. Магазин никотинамид и exendin-4 при температуре -20 ° С и активин βB и VEGF-при -80 ° С, а оттепель их непосредственно перед употреблением. Все полутвердых питательных сред компоненты должны находиться на льду во время обшивки. Следует отметить, что добавление VEGF-A был позже найден не является необходимым для образования колоний 2. Эмбриональной телячьей сыворотки подготовки. ФТС должно быть тепло инактивированной перед использованием. Инкубируйте ФТС в течение 30 минут при 56 ° С на водяной бане, чтобы инактивировать белки комплемента. Если начальный запас ФТС бутылка имеет более 500 мл аликвоту его в 125 мл флаконах. Увеличенной площадью поверхности будет обеспечивать еще и тщательное нагрев всего объема. Разрешить бутылки, чтобы охладить при комнатной температуре в течение по крайней мере за 1 час до хранения при температуре -20 ° C. Талая ФТС 0,2 мкм фильтруются перед использованием. Смешайте компоненты культуры с отсортированными клеток. Держите клетки и все полутвердых медиа компоненты на льду во время подготовки во все времена для предотвращения затвердеванияМатригель. Все материалы, которые вступают в контакт с Матригель в том числе, пипеток, шприцев и игл, должен быть холодным. Место этих поставок при температуре -20 ° С по крайней мере за полчаса до использования. Определить количество ячеек, которые будут посеяны на лунку в 24-луночного планшета. До 25000 клетки могут быть покрыты за 24-а. Можно выполнять титрования плотность клеток в первые эксперименты, чтобы определить оптимальное количество клеток посева. Добавить культуры компоненты 5 мл полистирола трубу с крышкой оснастки в последовательности, описанной в таблице 1 (обратите внимание, что клетки добавляются последнего, чтобы избежать преждевременной стимуляции). Добавить 3,3% метилцеллюлозы для полистирола труб первого и сортируются клетки в последнюю очередь. Обратите внимание, что на 3,3% метилцеллюлозы решение должно быть составлены и добавляется к полистирола труб с 16 ½ иглы и адекватно отмечен окончил шприц. В общем, для того, чтобы правильно измерить объем вязкие растворы, такие как 3,3% метилцеллюлозы зольution и конечной смеси культуры, важно для аспирации какое-то решение в шприце, а затем сразу же нажать на решение о высылке из воздуха. 3,3% метилцеллюлозы решение может быть нагрет до комнатной температуры, если это слишком трудно вытянуть. Тем не менее, убедитесь, что он охлаждали на льду после его разливали в полистирольных труб и перед добавлением Матригель. Пластина полутвердых средах, содержащих отсортированные клетки. Убедившись, шапки полистирола трубы твердо в месте, встряхните руками трубы энергично и основательно. Пузырьки воздуха будут генерироваться в ходе этого процесса. Место труб на льду в течение 5 минут или пока небольшой поверхности пузырьков воздуха. Используйте 1 мл шприц с 16 ½ и 18 ½-иглы для аспирации содержимого. Следуйте советам в 3.6.2 сделать точные объемы вязкий раствор без доступа воздуха в шприцах. Медленно обойтись 500 мкл среды в каждый 24-а. Использованиенизкой привязанности 24-луночного только. Добавить медиа непосредственно в центре хорошо. Полутвердых СМИ будут автоматически распространяться в скважинах. Для каждого экспериментального образца, quadruplicated скважины обычно используются для того, чтобы получить статистически значимые результаты. Только 4 внутренних колонн горизонтально ориентированным 24-луночного планшета используются для культуры. Заполните оставшиеся лунки стерильной водой для увлажнения помощи ячейки содержащие культуры. Инкубируйте клетки в 37 ° С и 5% CO 2 воздухе. Задержка Помимо факторов роста. Можно добавить факторов роста после начала культуры. Такие маневры могут быть использованы для решения выживание воздействием определенных факторов роста. Рост фактором решения до 100 мкл на лунку может быть капала через 1 мл шприц с 26 G 3 / 8 иглы и позволило диффундировать в полутвердую СМИ. 4. Наблюдение образования колоний под светом микроскопиисправляться Клетки должны быть соблюдены сразу же после покрытия для обеспечения, что отдельные клетки случайно и равномерно распределены по всему из скважин. Если большая часть клеток или в результате колонии распределены на периферии скважины, это будет означать, что отпуск полутвердых СМИ в скважинах был слишком сильный (см. раздел 3.7.4). В связи с колонией мениска эффект плотности на периферии культуры скважины может быть выше, по сравнению с теми, кто живет в центре. Количественной колонии номер. В связи с 3-мерной особенностью средств массовой информации, колоний появятся на различных координационных центров. Таким образом, корректировка фокус для каждой колонии могут потребоваться в ходе наблюдений с помощью световой микроскопии. Прикрепите сетку под 24-а при подсчете того, чтобы избежать регистрации одной колонии в два раза. Сетка может быть получена за счет сокращения стене Nunc petridish (кат. No.169558). 10-кратный объектив с оптическим микроскопом следует использовать для наблЭрве и подсчета колоний. 5. Представитель Результаты: Предыдущие эксперименты показали, что, начиная с 2,5 х 10 5 мышиных R1 ЭС клетки (в 50 мл общего СМИ) можно было бы ожидать, чтобы генерировать около 5000 соответствующего размера день-6 ЭТ. Ngn3-EGFP ЭС клетки были менее эффективными; 4 раза больше, клетки, необходимые для создания аналогичного размера ЭТ днем ​​6. Потому что 25 дней-6 ЭТ содержат в среднем на 1,88 ± 0,67 х 10 5 клеток, 1 примерно 37,6 х 10 6 клеток может быть получена от 5000 ЭТ. Во вложение культуре клетки, как ожидается, расширить 2,72 ± 0,32 раза. 1 Таким образом, 5000 день-6 ЭТ получается примерно 100 х 10 6 день-16 клеток, прежде чем сортировка. После стробирование, Ngn3-EGFP + клеток составит примерно 10% от общего день-16 клеточной популяции (Протокол текстовый раздел 2.2.5 и рис 3). Пример photomicrogrАФС инсулина экспрессией колонии основе мышиные клетки ES показано на рисунке 4. Эти колонии имеют отличительные морфологии; мала (~ 60-100 мкм), круглые колонии с отдельными клетками в колонии, которые маленькие, темные, а не свет отражать. В нашей предыдущей публикации, 2 в режиме реального времени RT-PCR и двойного иммунофлуоресцентного окрашивания индивидуально подобранных колоний показало, выражение инсулина, С-пептида и глюкагона. Эти результаты демонстрируют способность одним Ngn3-EGFP + клеток дифференцироваться в клетки, содержащие по крайней мере два островка гормоны одновременно, напоминающих примитивные первой волны, как эндокринные клетки. Колония тест для рассеянных отдельных клеток позволяет изучать для тех, прародителей, которые имеют возможность инициировать пролиферацию и дифференцировку в пробирке (рис. 5). Таким образом, это анализ, который может измерять внутренние функции отдельных клеток-предшественников. Прародителей, которые capability стать инсулин выражения колонии называются инсулин выражения колониеобразующих единиц (ICFUs) (рис. 5). В соответствии с идеей, что Ngn3 знаки эндокринные клетки предшественники в развивающихся поджелудочная железа, 5 Ngn3-EGFP +, но не Ngn3-EGFP -. Клеткам МЧС ячейка происхождения популяции обогащенные для ICFUs 2 Тем не менее, частота этих предшественников до сих пор низкий, около 0,1% до 0,6% от общего Ngn3-EGFP + населения изолирована от 16-й день культуры ICFUs 2 Независимо от этого, очевидна разница в колониеобразующих эффективности, как ожидается, с Ngn3-EGFP + клеток высокий, а затем. отсортированы клетки, а затем Ngn3-EGFP – клеток. Рисунок 1. Timeline в пробирке мышиные стволовые клетки поджелудочной железы дифференциации-подобных клеток. Для кондиционированной среде (СМ) поколения, мышиных ES челLs выращиваются в виде суспензии с 15% FCS в течение первых шести дней с уменьшением дозы monothioglycerol (6,0 х 10 -3 М в течение первых двух дней и 6,0 х 10 -4 М в течение последующих четырех дней) для создания EBS. День-6 ЭТ (80-100 на лунку), затем переведен в приложение 6-и блюд, содержащих 15% нокаут сыворотке замены. 5% FCS может быть добавлен между днями 6-10 культуры, чтобы ускорить присоединение EBS. Никотинамид, exendin-4, и человеческий рекомбинантный активин βB которые затем добавляются в средствах массовой информации на культуру 13-й день (см. раздел 1.1). СМИ собираются на культуру 16-й день и в этот момент стало кондиционированной среде. День 16 клетки затем сортируются и высевали в полутвердых сред для колонии анализа. Рисунок 2. Представителю микрофотография большой день-6 эмбриоидных органов производным от мышиных эмбриональных стволовых клеток. Идеальный день ЭТ-6, по меньшей мере 150 мкм в диаметрепараметром и потемнели центров (стрелки). Экспрессия ранних предшественников поджелудочной маркеров (например, PDX-1 и Sox9) усиливается в этих ЭТ (данные не представлены) 3. Рисунок 3. Сортировка ворота для MES ячейки полученных день-16-Ngn3 EGFP экспрессирующие клетки. () Вперед и боковые ворота разброс, что свидетельствует о размера ячейки и степень детализации, соответственно, устранить непористые мусора. (B) DAPI используется для идентификации мертвых клеток, которые будут окрашенных положительной, когда возбуждается на 405-413 нм и излучения обнаружен 450/40 фильтр. (C) Длительность импульса, ширина электронного импульса вперед разброс, показывает, дублеты, которые должны быть устранены перед передачей через активированный флуоресценции ячейка сортировщика. (D) Память о EGFP (канал FL1) по сравнению с использованием аутофлюоресценция день-16 клетки из родительского контроля клеточной линии, такие как TL1 (слева) освещает истинную флуоресценции и, таким образом Ngn3-EGFP <SUP> + клеточной популяции (правая панель). (Е) Красная стрелка показывает ручной сдвиг вправо от ворот EGFP + непосредственно перед сортировкой увеличить разделения ложных положительных клеток. События в обоих (D) и (Е) на основе закрытого регионов (R1 – R3) показано в (AC). Рисунок 4. Представителю микрофотографии инсулин выражения колоний в полутвердых культуры. Колонии случайным образом распределены и отображаются в виде небольших темных, не отражающих свет кластеров. Индивидуальные колоний в дальнейшем могут быть исследованы на экспрессию генов и белков методом ОТ-ПЦР и иммуногистохимического анализа, соответственно (не показан, см. видео). Рисунок 5. Колонии анализа, который позволяет функциональные и количественные оценки отдельных клеток-предшественников. Нумерация в результате колонии используется для расчета частотаuency из клеток-предшественников в общей покрытые клетками. Состав клеток в каждой колонии свидетельствует о линии потенциал инициирования прародителя. С помощью этого теста, мы обнаружили, что Ngn3-EGFP + клетки, полученные из мышиных эмбриональных стволовых клеток были обогащены в инсулине, экспрессирующих колониеобразующих единиц (ICFUs), клеток-предшественников, которые имеют способность дифференцироваться в инсулин-выражения колонии 2. Таблица 1. Мягкие Культурное Компоненты и порядок добавления.