En kvantitativ analyse for Insulin-uttrykke Colony-forming stamfedre

1. Differensiering av murine ES celler til bukspyttkjertelen-lignende celler in vitro å generere betinget media (CM) for koloni assay Prosedyrer for murine ES cell vedlikehold, har embryoid kroppen (EB) formasjonen i suspensjon kultur, og vedlegg kultur for ytterligere differensiering er tidligere beskrevet 1-3 og er ikke fokus for denne rapporten. En skjematisk presentasjon av trinnene involvert i differensiering protokollen er vist i figur 1. For å oppnå høy kvalitet betinget media, er det viktig å først generere 6-dagers gammel EBS der minst 30-40% av dem er med diameter på minst 150 mikrometer. De større EBS bør inneholde mørke flekker under lysmikroskop, tyder forbedret differensiering (figur 2). Valg av høy kvalitet kalvefoster serum (FCS) er kritisk til å generere slike EBS. Høy kvalitet FCS mange er valgt basert på deres evne til å støtte differentiation av EBS mot insulin 1, glukagon og amylase 2A genuttrykk i de senere stadier (dag 18-20) som oppdages av RT-PCR-analyse. Videre er når dagen-6 EBS overføres fra suspensjon kultur til vedlegg kultur (ca. 80-100 EBS per brønn i 6 godt plater) er det viktig å forsiktig rotere platene å samle dag-6 EBS inn i sentrum av brønnene. For ukjente grunner, manøvrer som øker celle-celle kontakter resultere i bedre utvikling av pankreas-lignende celler fra EBS i den påfølgende vedlegget kulturen scenen. På kultur Dag 13, skifte vedlegget kultur media (DMEM/F-12 (1:1), 15% knockout serum erstatning, 2 mm L-glutamin, 50 U / mL penicillin, 50 mikrogram / ml streptomycin) med ferske vedlegg kultur media containing10 mM nikotinamid, 0,1 nM exendin-4, og 10 ng / ml humane rekombinante activin SSB (alle konsentrasjoner er endelige). På kultur dag 16, samle media fra trinn 1,1 og filtrere det gjennom et 0,2 mikrometer polyetereulfone membran. Fra dette punktet frem de innsamlede media vil bli referert til som betinget media (CM). Delmengde av CM i 15 ml Falcon rør og lagre den ved -80 ° C før like før halvfast kultur (se punkt 3 nedenfor). 2. Innhenting av pankreas-lignende stamfedre i én celle suspensjon bruke en fluorescens aktivert celle sorter En knock-in murine ES cellelinje, 4 utpekt som Ngn3-EGFP, der EGFP reporter genet erstattet et allel av Ngn3 locus ble differensierte som tidligere beskrevet. 2 Ngn3 er en grunnleggende helix-loop-helix (bHLH) inneholder transkripsjonsfaktor . uttrykkes av pankreas endokrine stamfedre under utvikling 5 dagers-16 kulturer var normalt sortert å skaffe differensierte Ngn3-EGFP + og Ngn3-EGFP -. celler 1,2 Dissosiasjon av differensierte celler i en enkelt celle suspensjon. Inkuber dag-16 kulturer with 0,25% trypsin-EDTA (3 min, 37 ° C) for å løsne cellene fra kultur brønner. Legge til 10% FCS å stoppe trypsin aktivitet. Vask cellene med magnesium og kalsium-free fosfat-buffered saltløsning (PBS) som inneholder 0,1% bovint serum albumin (BSA), og sentrifuger ved 300 xg i 5 min. Fjern supernatanten og inkuber cellen klumper med 4 mg / ml collagenase B og 2000 U / mL deoxyribonuclease (DNase) I (30 min, 37 ° C) for å produsere en enkelt celle suspensjon. Bruk en 1000 mL pipette for å forstyrre cellen pellets hvert 10 min for å fremskynde dissosiasjon prosessen. Vask celler med PBS som inneholder 0,1% BSA, og sentrifuger ved 300 xg i 5 min. Fjern supernatanten og resuspender cellene i PBS som inneholder 0,1% BSA. Utarbeidelse av celler for sortering. Tilsett 2 mL DNase I (1 MU / ml) for hver ml cellesuspensjon å hindre celle reaggregation under sortering. Pass på én cellesuspensjonen gjennom en 40-70 mikrometer mEsh å fjerne store celle aggregater. Legg DAPI (1 mikrogram / mL endelig konsentrasjon) til den enkelt celle suspensjon. Skaff flowcytometri data på en celle sorter. En MoFlo MLS (Beckman Coulter) celle sorter ble brukt for denne rapporten. Gating av celle populasjoner for sortering. Ngn3-EGFP + og Ngn3-EGFP – celler er gated først med fremover scatter vs side scatter (figur 3A), etterfulgt av DAPI vs side scatter (Figur 3B), pulsbredde vs side scatter (Figur 3C), og til slutt FL1 kontra auto-fluorescens (Figur 3D). Den endelige slags gate av Ngn3-EGFP + celler er vilje flyttet til høyre (Figur 3E, pil) for å begrense forurensing av Ngn3-EGFP – celler under sortering. For negativ kontroll gating, enten dag-6 EBS fra Ngn3-EGFP ES linje eller i samme scene, dag-16 kulturen fra et ikke-transgen linje, for eksempel TL1 ES celler (Figur 3D, venstre panel), kan brukes. Sorter Ngn3-EGFP + og Ngn3-EGFP <sup> – celler. 3. Plating sortert celler til semi-solid kultur Matrigel forberedelse. Delmengde av Matrigel til 1 ml per rør og oppbevar ved -20 ° C før bruk. Frossen alikvoter bør plasseres ved 4 ° C over natten eller på is i 3 timer å tine like før bruk. Tinte alikvoter må være på isen under halvfast kultur forberedelse til å unngå resolidification. Methylcellulose løsning (3,3%) forberedelse. Methylcellulose pulver kan ikke autoklaveres. For å få bakterier-free methylcellulose løsning, bruk ren veiing båter og autoklaveres røre barer, begerglass, kolber og annen maskinvare under forberedelse prosessen. En dag før methylcellulose løsningen forberedelse, 200 lagre mL sterilt dobbelt destillert vann ved 4 ° C. Også forberede 500 ml 2x DMEM/F12 media (forberede seg ved å løse opp pulverisert DMEM / F-12 i doblet destillert vann) inneholder 100 U / mL penicillin og100 mikrogram / mL streptomycin og oppbevar ved 4 ° C. På dagen for methylcellulose forberedelse, legge 500 ml sterilt dobbelt destillert vann til en 1000 ml glass beholder med et stykke aluminiumsfolie på toppen. Kok i minst 30 min å bli kvitt vannet av luftbobler. Plasser en stor størrelse røre bar (minst 3 inches i lengde) i et 2000 ml glass kolbe. Mål 300 ml kokende vann og overføre den til kolben. Sett flasken på et rør plate (uten oppvarming). Sakte røre varmt vann for å unngå generere luftbobler. Veier 33 gram methylcellulose pulver og veldig sakte legge den til varmt vann. Varmt vann er nødvendig for å fukte methylcellulose pulver effektivt og hjelpe den påfølgende oppløsningen i kald temperatur. Fortsett å røre pulveret til temperaturen er redusert til ca 40-45 ° C. Tilsett 200 ml kaldt sterilt dobbelt destillert vann til kjøling methylcellulose blandingen. Umiddelbartetter, bør du begynne å se løsningen snu gjennomsiktig og tyktflytende, noe som indikerer at methylcellulose løser seg opp i den vandige fasen. Hånd virvel flasken for å sikre at løsningen er blandet grundig. Tilsett 500 ml kaldt 2x DMEM/F12 media. Fortsett å virvle hånd å blande. Sett flasken på et rør plate i et kaldt rom, og sakte rør methylcellulose løsningen for 24-48 timer. Delmengde løsningen i 125 ml per lagring flaske, og oppbevar ved -20 ° C. En prøve bør fravikes i en steril petridish og plassert i 37 ° C inkubator for å teste sterilitet. Tinte methylcellulose løsning kan oppbevares i kjøleskap i inntil 2 måneder. Betinget media forberedelse. Tine CM (se kapittel 1) like før bruk. Hold CM på is hele halvfast kultur forberedelse. Forbered følgende vekstfaktorer: 1,0 M nikotinamid, 0,1 mM exendin-4, 10 mikrogram / ml rekombinant human activin βB, og 10 & mu, g / mL VEGF-A. Oppbevar nikotinamid og exendin-4 ved -20 ° C og activin βB og VEGF-A ved -80 ° C, og tine dem umiddelbart før bruk. All halvfast vekstmedium komponenter bør holdes på is platekledning. Det bør bemerkes at tillegg av VEGF-A ble senere funnet ikke nødvendig for koloni formasjon. 2 Kalvefoster serum forberedelse. FCS bør varme inaktivert før bruk. Inkuber FCS i 30 minutter ved 56 ° C i vannbad for å inaktivere komplement proteiner. Hvis det første FCS lager flaske inneholder mer enn 500 ml delmengde det inn 125 ml hetteglass. Den økte arealet vil sikre jevn og grundig oppvarming av hele volumet. La flaskene kjøles ned ved romtemperatur i minst 1 time før lagring ved -20 ° C. Tinte FCS er 0.2μm filtreres før bruk. Bland kultur komponenter med sorterte celler. Hold celler og alle semi-faste medier komponenter på is under forberedelse til enhver tid å hindre at størkning avMatrigel. Alle forsyninger som kommer i kontakt med Matrigel inkludert, bør pipettespisser, sprøyter og nåler, være kaldt. Plasser disse forsyninger ved -20 ° C i minst en halv time før bruk. Bestem mengden av celler til å bli seedet per brønn i en 24-brønns plate. Opptil 25 000 celler kan være belagt per 24-brønnen. Man kan utføre en titrering av celle tetthet i innledende forsøk for å bestemme optimal seeding celle nummer. Legg til kultur komponenter til en 5 ml polystyren rør med et blunk cap i den rekkefølgen som er beskrevet i Tabell 1 (merk at cellene er lagt siste for å unngå for tidlig stimulering). Tilsett 3,3% methylcellulose til polystyren rør første og sorterte cellene siste. Merk at 3,3% methylcellulose løsning må utarbeides og legges til i polystyren rør med en 16 ½ gauge nål og en tilstrekkelig merket gradert sprøyte. Generelt, for å riktig måle volumet av viskøse løsninger, som for eksempel 3,3% methylcellulose solution og den endelige kultur blandingen, er det viktig å aspirer noen løsning i sprøyten først, og deretter umiddelbart skyve løsningen ut til å utvise luften. Den 3,3% methylcellulose løsning kan være oppvarmet til romtemperatur hvis den er for vanskelig å trekke ut. Men at den blir kjølt på is etter at det er dispensert inn i isopor rør og før tillegg av Matrigel. Plate det semi-faste medier som inneholder sortert celler. Etter sikre caps av polystyren rørene er på plass, riste rørene med hendene kraftig og grundig. Luftbobler vil bli generert i løpet av denne prosessen. Sett rørene på is i 5 min eller til de små luftbobler overflate. Bruk en 1 ml sprøyte med en 16 ½ og 18 ½-gauge nål til å suge ut innholdet. Følg rådene i 3.6.2 å trekke nøyaktig volum av viskøs løsning uten luft i sprøyter. Sakte dispensere 500 ul av media i hver 24-brønnen. Brukden lave vedlegget 24-bra plater bare. Legg til media direkte til sentrum av brønnen. Den semi-faste medier vil automatisk spre seg ut i brønnene. For hver eksperimentell prøve, er quadruplicated brønner rutinemessig brukes for å oppnå statistisk signifikante resultater. Bare de fire innerste kolonnene i en horisontalt orientert 24-bra plate brukes til kultur. Fyll resterende brønnene med sterilt vann for å hjelpe fukting av cellen som inneholder kultur. Inkuber cellene i 37 ° C og 5% CO 2 luft. Forsinket tilførsel av vekstfaktorer. Det er mulig å legge vekstfaktorer etter initiering av kulturen. Slike manøvrer kan brukes til å adressere overlevelse effektene av visse vekstfaktorer. Vekstfaktor løsninger opptil 100 mL per brønn kan være dryppet via en 1 ml sprøyte med en 26 G 3 / 8 nål og lov til å diffus i semi-faste medier. Fire. Observere koloni formasjon under lyset MICROStakle Cellene må observeres umiddelbart etter plating å sikre at enkeltceller er tilfeldig og jevnt fordelt i hele ut brønnene. Hvis de fleste av cellene eller den resulterende koloniene er fordelt på marginen av brønnene, vil dette indikere at dispenserer det semi-faste medier i brønnene var for kraftig (se avsnitt 3.7.4). På grunn av den meniscus effekten kolonien tetthet ved utkanten av kulturen brønnene kan være høyere sammenlignet med de som bor i sentrum. Colony nummer kvantifisering. På grunn av den 3-dimensjonale funksjon i media, vil koloniene vises på ulike knutepunkter. Dermed kan en justering av fokus for hver koloni være nødvendig under observasjon ved lysmikroskopi. Fest et rutenett under 24-godt når telling for å unngå å registrere den samme kolonien to ganger. Et rutenett kan oppnås ved å kutte veggen av et Nunc petridish (Kat. No.169558). En 10x objektiv på et lysmikroskop bør brukes til observe og telle koloniene. 5. Representant Resultater: Tidligere forsøk hadde vist at det å starte med 2,5 x 10 5 murine R1 ES celler (i 50 mL media totalt) kunne man forvente å generere omtrent 5000 passende størrelse dag-6 EBS. Den Ngn3-EGFP ES cellene var mindre effektive; 4 ganger flere celler ble pålagt å generere tilsvarende store EBS etter dag seks. Fordi 25 dagers-6 EBS inneholder et gjennomsnitt på 1,88 ± 0,67 x 10 5 celler, 1 ca 37,6 x 10 6 celler kan fås fra 5000 EBS. Under vedlegg kultur cellene er forventet å utvide 2.72 ± 0.32 fold. 1 Dermed vil 5000 dag-6 EBS gir ca 100 x 10 6 dagers-16 celler før sortering. Etter gating vil Ngn3-EGFP + celler utgjør ca 10% av den totale dag-16 cell befolkningen (Protocol Tekst avsnitt 2.2.5 og figur 3). Eksempel på photomicrographs av insulin-uttrykke kolonier avledet fra murine ES celler er vist i Figur 4. Disse kolonier har en karakteristisk morfologi, liten (~ 60-100 mikrometer) runde kolonier med individuelle celler i koloniene som er små, mørke og ikke lys reflekterende. I vår forrige publisering, avslørte to real-time RT-PCR og dobbel immunofluorescent farging av individuelt håndplukkede kolonier uttrykk for insulin, C-peptid og glukagon. Disse resultatene demonstrerer evne til singel Ngn3-EGFP + cellene differensieres til celler som inneholder minst to holme hormoner samtidig, ligner primitive første bølge som endokrine celler. Kolonien analysen for spredt enkeltceller gjør studiet for de stamfedre som har kapasitet til å initiere spredning og differensiering in vitro (figur 5). Dermed er dette en analyse som kan måle den iboende funksjon av individuelle stamceller. Forfedrene som har capabiheten for å bli insulin-uttrykke kolonier kalles insulin-uttrykke kolonidannende enheter (ICFUs) (figur 5). Konsekvent til ideen om at Ngn3 markerer endokrine stamceller i utviklingsland bukspyttkjertelen, 5 Ngn3-EGFP +, men ikke Ngn3-EGFP -. Celler fra MES celle-avledet populasjoner er beriket for ICFUs to Imidlertid er frekvensen av disse stamfedre fortsatt lav, ca 0,1% til 0,6% av den totale Ngn3-EGFP + befolkningen isolert fra dag 16 kulturen er ICFUs to Uansett, en klar forskjell i koloni-forming effektivitet er forventet, med Ngn3-EGFP + celler det høyeste, etterfulgt av. presorted celler, og deretter Ngn3-EGFP – celler. Figur 1. Timeline av in vitro murine ES celler differensiering til bukspyttkjertelen-lignende celler. For betinget media (CM) generasjonen, murine ES cells dyrkes i suspensjon med 15% FCS for de første seks dagene med minkende doser av monothioglycerol (6,0 x 10 -3 M for de to første dagene og 6,0 x 10 -4 M for følgende fire dager) til å generere EBS. Dag-6 EBS (80-100 per brønn) blir deretter overført til vedlegg 6-godt rettene inneholder 15% knockout serum erstatning. 5% FCS kan legges mellom dager 6-10 kultur for å fremskynde feste EBS. Nikotinamid, er exendin-4 og humane rekombinante activin βB deretter lagt til media på kulturen dag 13 (se kapittel 1.1). Media er samlet på kultur dag 16 og på dette punktet har blitt kondisjonert media. Dag 16 cellene blir deretter sortert og belagt i semi-faste medier for koloni analysen. Figur 2. Representative mikrofotografiet av store dagen-6 embryoid organer avledet fra murine embryonale stamceller. Ideell dag-6 EBS er minst 150 mikrometer i diameterevige og har mørke sentre (piler). Expression of tidlig bukspyttkjertelen progenitor markører (som PDX-1 og Sox9) er forbedret i disse EBS (data ikke vist). 3 Figur 3. Sortering porter for MES celle-stammer dag-16 Ngn3-EGFP uttrykker cellene. (A) Forward og side scatter porter, en indikasjon på celle størrelse og detaljnivå henholdsvis eliminere ikke-cellulær rusk. (B) DAPI brukes til å identifisere døde celler, som vil være farget positivt når spent på 405-413 nm og utslipp oppdages med en 450/40 filter. (C) Pulsbredde, bredden på elektronisk frem scatter puls, avslører dubletter, som bør fjernes før den passerte gjennom fluorescens aktivert celle sorter. (D) Gating av EGFP (kanal FL1) versus autofluorescence bruker dag-16 celler fra en kontroll foreldrenes cellelinje som TL1 (venstre panel) lyser ekte fluorescens og dermed Ngn3-EGFP <sup> + celle befolkningen (høyre panel). (E) Rød pil viser manuell høyre-shift av EGFP + gate like før sortering for å øke separasjon av falske positive celler. Hendelser i begge (D) og (E) er separert basert på regioner (R1 – R3) vist i (AC). Figur 4. Representative photomicrographs av insulin-uttrykke kolonier i semi-solid kultur. Kolonier er tilfeldig fordelt, og fremstår som lite mørkt, ikke lys reflekterende klynger. Individuelle kolonier kan senere bli analysert for gen og protein uttrykk ved RT-PCR og immunhistokjemi analyser, henholdsvis (ikke avbildet, se video). Figur 5. En koloni analysen som gjør at funksjonelle og kvantitative vurderinger av enkelt stamceller. Numeration av den resulterende koloniene blir brukt til å beregne frequency av stamceller blant den totale belagt celler. Sammensetningen av celler innenfor hver koloni er et tegn på avstamning potensialet i initiering stamfar. Ved hjelp av denne analysen, fant vi at Ngn3-EGFP + celler avledet fra murine embryonale stamceller var beriket for insulin-uttrykke koloni-forming units (ICFUs), progenitor celler som har evnen til å skille ut insulin-uttrykke kolonier. 2 Tabell 1. Halvfast Kultur Media Components og Order of tillegg.