इंसुलिन व्यक्त कालोनी बनाने progenitors के लिए एक मात्रात्मक परख
Summary
एक तीन आयामी clonogenic परख है कि अग्नाशय की तरह progenitors इंसुलिन व्यक्त कालोनियों में अंतर करने के लिए अनुमति देता है वर्णित है. इस विधि अर्द्ध ठोस methylcellulose Matrigel, और वृद्धि कारकों से युक्त मीडिया का लाभ लेता है, जिसमें एकल progenitors पैदा करना और अंतर<em> इन विट्रो में</em> आबादी में कार्यात्मक progenitors की संख्या की मात्रा का ठहराव की अनुमति.
Abstract
The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate “pancreatospheres” in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 μL of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin βB, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.
Protocol
Discussion
कालोनी assays कि व्यक्ति अग्नाशय के progenitors के मात्रात्मक और कार्यात्मक मूल्यांकन की अनुमति अभी तक सीमित किया गया है, जो बहुत अग्नाशयी स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिका जीव विज्ञान की पढ़ाई में प्रगति में बाधा है. एक कॉलोनी परख का सार यह है कि यह पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की आंतरिक क्षमता है, बजाय केवल अपने phenotype के उपाय, पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की कार्यक्षमता और वंश क्षमता में मनाया जा करने के लिए अनुमति है. यह भी एक मात्रात्मक उपकरण है कि एक दिया आबादी में progenitors की संख्या निर्धारित कर सकते है. Hematopoietic स्टेम सेल के क्षेत्र में, कॉलोनी assays पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वृद्धि कारक आवश्यकताओं, बातचीत, और तंत्र इन कोशिकाओं के वंश प्रतिबद्धता शासी गूढ़ रहस्य अग्नाशय के पूर्वज कोशिका जीव विज्ञान, अग्नाशय 7 अंग के क्षेत्र में 6 . , 8 या थोक संस्कृतियों 9-13 तैयार किया गया है, तथापि, ऐसे assays जैविक questi नहीं पता नहींएकल कोशिका के स्तर पर ons. एकल कक्ष विश्लेषण के बिना, बहु संभावित अग्नाशय स्टेम / progenitors के अस्तित्व को स्पष्ट नहीं किया जा सिद्ध कर सकते हैं. 14
यहां हम बताते हैं कि इंसुलिन व्यक्त कॉलोनी बनाने progenitors एक तीन आयामी, Matrigel युक्त, संस्कृति अर्द्ध ठोस प्रणाली का उपयोग assayed किया जा सकता है. हालांकि निलंबन संस्कृति 15,16 प्रणाली विकसित किया गया है जो एक वयस्क अग्नाशय के progenitors पैदा करना और "pancreatospheres" में अंतर परमिट, हमारी कॉलोनी परख अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है है . सबसे पहले, हमारी संस्कृति अर्द्ध ठोस मीडिया प्रणाली की अनुमति देता है इसके विपरीत, 25,000 24 अच्छी तरह से प्रति हल प्रति 500 μL संस्कृति मीडिया कोशिकाओं जबकि रेखीय श्रृंखला में जिसके परिणामस्वरूप कॉलोनी गठन को बनाए रखने के चढ़ाना 2. निलंबन pancreatosphere परख एकल उपयोग की आवश्यकता सेल सेल सॉर्टर से बयान विधि एकल कक्ष विश्लेषण करने की अनुमति है, और इस प्रकार संस्कृति मीडिया और इनक्यूबेटर अंतरिक्ष की एक बड़ी मात्राआवश्यक हैं. इसलिए, हमारी कॉलोनी परख अपेक्षाकृत आसान और लागत प्रभावी है आचरण के लिए जब विभिन्न कक्षों की एक बड़ी संख्या पूर्वज गतिविधियों के लिए एक साथ तुलना करने की आवश्यकता है. दूसरा, हमारे अर्द्ध ठोस मीडिया बाह्य मैट्रिक्स घटक और वृद्धि कारक है, जो प्रसार और भेदभाव दोनों एक ही कुएं में होने के लिए अनुमति देता है के समान वितरण की अनुमति देता है. इसके विपरीत, इसे और अधिक कठिन है निलंबन संस्कृति में कोशिकाओं को ऐसे माहौल, विशेष रूप से मैट्रिक्स, प्रदान. हम जानते हैं कि हमारे विधि के साथ यह निश्चित नहीं किया जा साबित कर दिया कि प्रत्येक उपनिवेश एक एकल कोशिका से ली गई है सकते हैं, के रूप में दो progenitors बेतरतीब ढंग से एक दूसरे को और फार्म का एक कॉलोनी के पास तैनात किया जा सकता है. हालांकि, इस समस्या को माध्यमिक एकल कक्ष हेरफेर का उपयोग विश्लेषण द्वारा दूर किया जा सकता है. सॉर्ट किया गया एकल कोशिकाओं के प्रत्यक्ष हाथ उठा निश्चित प्रत्येक कॉलोनी के एकल कक्ष मूल का प्रदर्शन कर सकता है.
सारांश में, इंसुलिन व्यक्त समर्थक की कॉलोनी के गठन गतिविधिअर्द्ध ठोस मीडिया में genitors वर्णित इस के साथ साथ एकल कोशिका के स्तर पर अग्नाशय के progenitors के यंत्रवत अध्ययनों के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, एक पूर्व रिपोर्ट में हम Matrigel, बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन की एक कच्चे मिश्रण की है कि अतिरिक्त पाया, मीडिया संस्कृति में इंसुलिन Ngn3-EGFP + कोशिकाओं, 2 से व्यक्त कालोनियों बाह्य मैट्रिक्स का सुझाव दे के गठन के लिए आवश्यक है उन progenitors के लिए महत्वपूर्ण है. इस कॉलोनी परख का प्रयोग, यह अब संभव हो सकता है आगे टुकड़े करना और इस तरह की गतिविधि के लिए विशिष्ट मैट्रिक्स आवश्यकताओं को परिभाषित करेगा. माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न progenitors का अध्ययन करने के अलावा, हम वर्तमान में जांच कर रहे हैं कि इस में इन विट्रो परख प्रणाली भी अन्य विशिष्ट कालोनियों प्रसवकालीन और वयस्क चूहों के अग्न्याशय और जिगर से व्युत्पन्न के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मानव शव का अग्नाशय रहित ऊतकों से के गठन का समर्थन करता है islets की.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों murine Ngn3-EGFP भ्रूण स्टेम सेल लाइन, श्रीमती लूसी ब्राउन और सेल छँटाई में सहायता के लिए विश्लेषणात्मक Cytometry कोर के उपहार के लिए डा. क्लाऊस Kaestner धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के हिस्से में एनआईएच R21DK069997 अनुदान और R01DK081587 HTK के लिए सम्मानित किया गया और पुनर्योजी चिकित्सा (सीआईआरएम) के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट से प्रशिक्षण मेगावाट और लोकसभा के लिए सम्मानित किया अनुदान से वित्त पोषित किया गया
Materials
| Material/ Reagent | Company | Catalogue Number |
Comments |
| 1X DMEM/ F-12 (1:1) | Mediatech | 15-090-CV | |
| Fetal Calf Serum | Tissue Culture Biologicals |
201 | Refer to Section 1.1 |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1X Dulbecco’s PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| Bovine Serum Albumin |
Sigma | A8412 | 7.5 % |
| Matrigel | Becton Dickinson |
356231 | Reduced Growth Factor |
| Methylcellulose | Sinetsu Chemical, Tokyo, Japan |
1,500 centipoise (high-viscosity) |
|
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| Human Recombinant Activin βB |
R & D Systems | 659-AB-025 | |
| Exendin-4 | Sigma | E7144 | |
| Human Recombinant VEGF-A |
R & D Systems | 293-VE-010 | |
| 24-well plates | Costar | 3473 | Ultra-low Attachment |
| 60mm Petri Dish with Grid |
Nunc | 169558 |
Referências
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