Assay כמותי עבור אינסולין להביע המושבה יוצרי אבות

1. התמיינות של תאים עובריים Murine על הלבלב כמו תאים במבחנה ליצור מדיה מותנית (CM) עבור assay המושבה נוהלי תחזוקה ES Murine התא, embryoid (EB) היווצרות הגוף בתרבות ההשעיה, תרבות מצורף עבור בידול נוסף תוארו בעבר 1-3 והם אינם במוקד דו"ח זה. מצגת סכמטי של המעורבים פרוטוקול הבידול שלנו הוא שמוצג באיור 1. על מנת לקבל איכות גבוהה התקשורת מזגן, חשוב קודם כל ליצור 6-EBS בן יומו שבו לפחות 30-40% מהם הם עם קוטר של לפחות 150 מיקרומטר. EBS גדול צריך להכיל כתמים כהים תחת מיקרוסקופ אור, דבר המצביע על בידול משופרת (איור 2). מבחר גבוה העובר איכות עגל בסרום (FCS) הוא קריטי כדי להפיק EBS כאלה. איכות גבוהה הרבה FCS נבחרו על בסיס יכולתם לתמוך differentiatיון של EBS לקראת 1 אינסולין, גלוקגון ו – גן עמילאז 2A ביטוי בשלבים מאוחרים יותר (18-20 יום), זוהה על ידי ניתוח RT-PCR. יתר על כן, כאשר יום-6 EBS מועברים מתרבות לתרבות ההשעיה מצורף (כ 80-100 EBS לכל טוב 6 צלחות טוב) חשוב לסובב בעדינות את הצלחות לאסוף את יום-6 EBS למרכז בארות. מסיבות, תמרונים לא ידוע המשפרים תאים תאים קשר לגרום להתפתחות טובה יותר של הלבלב דמויי תאים EBS את השלב שלאחר מכן מצורף תרבות. ביום התרבות 13, להחליף את התרבות מצורף מדיה (DMEM/F-12 (1:1), החלפת בנוקאאוט 15% נסיוב, 2 מ"מ L-גלוטמין, 50 U / mL פניצילין, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין) עם תרבות מצורף טרי התקשורת containing10 nicotinamide מ"מ, 0.1 nM exendin-4, ו 10 ng / mL אנושי רקומביננטי activin SSB (ריכוז כל הסופי). ביום התרבות 16, לאסוף את המדיה צעד 1.1 ולסנן אותה דרך polyethers 0.2 מיקרומטרulfone הממברנה. מכאן ואילך התקשורת ייאספו המכונה בתקשורת מותנה (CM). Aliquot 15 ס"מ לתוך צינורות מ"ל פלקון ולאחסן אותו ב -80 ° C עד לפני רק לתרבות חצי מוצק (ראה סעיף 3 להלן). 2. קבלת הלבלב כמו אבות ההשעיה תא בודד באמצעות סדרן הקרינה התא הפעיל עקום בקו ES Murine התא, 4 כאזור Ngn3-EGFP, שם כתב את הגן EGFP החליף אלל אחד של מוקד Ngn3 היה מובחן כפי שתואר לעיל. 2 Ngn3 הוא גורם הסליל לולאה, סליל (bHLH) המכיל בסיסי שעתוק . הביע האנדוקרינית במהלך התפתחות הלבלב אבות יום 5-16 תרבויות מוינו בדרך כלל כדי להשיג בידול Ngn3-EGFP + ו-Ngn3 EGFP -. בתאים 1,2 דיסוציאציה התמיינות של תאים לתוך ההשעיה תא בודד. יום דגירה-16 תרבויות wiה 0.25% טריפסין-EDTA (3 דקות, 37 ° C) כדי לסלק את התאים מבארות תרבות. הוסף 10% FCS להפסיק פעילות טריפסין. שטפו תאים עם מגנזיום סידן ללא פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) המכיל 0.1% אלבומין בסרום שור (BSA), ועל צנטריפוגות ב XG 300 דקות 5. הסר supernatant ו דגירה גושי תאים עם 4 מ"ג / מ"ל ​​collagenase B ו 2000 U / mL deoxyribonuclease (DNase) אני (30 דקות, 37 ° C) כדי לייצר ההשעיה תא בודד. השתמש פיפטה 1000 μL לשבש את כדורי כל תא 10 דקות כדי לזרז את תהליך הניתוק. שטפו תאים עם PBS המכיל BSA 0.1%, ו צנטריפוגות ב XG 300 דקות 5. הסר supernatant ו resuspend התאים PBS המכיל BSA 0.1%. הכנת תאים למיון. הוסף 2 μL DNase אני (1 MU / mL) להשעיה כל תא מ"ל כדי למנוע reaggregation התא במהלך המיון. לעבור את ההשעיה תא בודד דרך מ 40-70 מיקרומטראש כדי להסיר אגרגטים תא גדול. הוסף DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל ​​ריכוז סופי) כדי ההשעיה תא בודד. רוכשת cytometry זרימת נתונים על סדרן תא. MLS MoFlo (Beckman Coulter) סדרן תא שימש בדוח זה. Gating של אוכלוסיות תאים למיון. Ngn3-EGFP + ו-Ngn3 EGFP – תאים מגודרת הראשון עם פיזור קדימה לעומת פיזור בצד (איור 3A), ואחריו DAPI לעומת פיזור בצד (איור 3B), רוחב הדופק לעומת פיזור בצד (איור 3 ג), ולבסוף FL1 לעומת פלואורסצנציה אוטומטי (איור 3D). השער מיון סופי של Ngn3-EGFP + תאים מועבר בכוונה ימינה (איור 3E; חץ), במטרה לצמצם זיהום Ngn3-EGFP – תאים במהלך המיון. עבור gating שליטה שלילית, בין אם מתוך Ngn3-EGFP קו ES או לשלב אותו, היום 16 תרבות מן השורה שאינו מהונדס, כגון תאים TL1 ES (איור 3D, פאנל משמאל), יכול לשמש יום-6 EBS. מיין Ngn3-EGFP + ו-Ngn3 EGFP <sup> – תאים. 3. ציפוי תאים ממוינים לתרבות מוצקים למחצה Matrigel הכנה. Matrigel Aliquot ל 1 מ"ל לכל צינור ולאחסן ב -20 ° C לפני השימוש. Aliquots קפוא צריך להיות ממוקם על 4 מעלות צלזיוס או על קרח בן לילה במשך 3 שעות רק כדי להפשיר לפני השימוש. Aliquots מופשר חייב להישאר על הקרח במהלך הכנת מוצקים למחצה תרבות להימנע resolidification. פתרון Methylcellulose (3.3%) הכנה. אבקת Methylcellulose לא ניתן autoclaved. על מנת לקבל חיידקים ללא פתרון methylcellulose, להשתמש בסירות במשקל נקי ברים ומערבבים autoclaved, כוסות, צלוחיות ורכיבי חומרה אחרים במהלך תהליך ההכנה. יום אחד לפני הכנת פתרון methylcellulose, 200 מ"ל לאחסן מים מזוקקים סטריליים כפול 4 ° C. כמו כן, להכין 500 מ"ל של 2x DMEM/F12 מדיה (מכינים על ידי המסת אבקת DMEM / F-12 ב הוכפל מים מזוקקים) המכיל 100 U / mL פניצילין100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין ולאחסן ב 4 ° C. ביום של התכשיר methylcellulose, מוסיפים 500 מ"ל מים מזוקקים סטרילית כפולה כוס זכוכית 1000 מ"ל עם חתיכת נייר אלומיניום על גבי. מרתיחים במשך דקה לפחות 30 כדי לפטור את המים של בועות אוויר. המקום בר גדול ומערבבים בגודל (לפחות 3 ס"מ אורך) אל תוך בקבוק זכוכית 2000 מ"ל. מדד 300 מ"ל מים רותחים ולהעביר אותו הבקבוק. מניחים את הבקבוק על צלחת מערבבים (ללא חימום). לאט לאט לבחוש את המים החמים, כדי למנוע יצירת בועות אוויר. שקול 33 גרם של אבקה methylcellulose ולאט לאט להוסיף את המים החמים. מים חמים יש צורך להרטיב את האבקה methylcellulose ביעילות הסיוע בעקבות פירוק בטמפרטורה קרה. ממשיכים לערבב את האבקה עד שהטמפרטורה יורדת בכ 40-45 ° C. מוסיפים 200 מ"ל מים קרים סטרילי מזוקק כפול לתערובת methylcellulose קירור. מידלאחר מכן, אתה צריך להתחיל לראות את הפתרון להפוך שקופה צמיגה, דבר המצביע methylcellulose כי היא מתמוססת לתוך השלב מימית. מערבולת יד את הבקבוק על מנת להבטיח את הפתרון הוא מעורב באופן יסודי. מוסיפים 500 מ"ל קר 2x DMEM/F12 התקשורת. ממשיכים לערבל ביד לערבב. מניחים את הבקבוק על צלחת ומערבבים בחדר קר, ולאט לאט ומערבבים הפתרון methylcellulose עבור 24-48 שעות. Aliquot הפתרון לתוך 125 מ"ל לבקבוק אחסון, לאחסן ב -20 ° C. מדגם צריך לוותר לתוך petridish סטרילית והושמו 37 ° C חממה לבדוק עקרות. פתרון methylcellulose מופשר ניתן לשמור במקרר עד 2 חודשים. הכנה התקשורת אילף. CM הפשירי (ראה סעיף 1) רק לפני השימוש. שמור את CM על הקרח ברחבי הכנה מוצקים למחצה תרבות. הכן את גורמי גדילה הבאים: 1.0 M nicotinamide, 0.1 מיקרומטר exendin-4, 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​אנושי רקומביננטי activin βB, ו 10 & mu, g / mL VEGF-A. חנות nicotinamide ו exendin-4 ב -20 ° C ו activin βB ו VEGF-A ב -80 ° C, ו להפשיר אותם מיד לפני השימוש. חצי מוצק כל רכיבי התקשורת בתרבות יש לשמור על הקרח במהלך ציפוי. יצוין כי תוספת של VEGF-A נמצאה מאוחר יותר לא הכרחי להקמת המושבה. 2 עגל הכנה עוברית בסרום. FCS יש חום מומת לפני השימוש. דגירה FCS למשך 30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס באמבט מים כדי להשבית החלבונים משלימים. אם את הבקבוק המניות הראשוני FCS מחזיקה יותר מ 500 מ"ל aliquot אותו לתוך צלוחיות 125 מ"ל. שטח הפנים גדל יבטיח חימום אפילו וממצה של כל נפח. אפשר הבקבוקים להתקרר בטמפרטורת החדר במשך שעה לפחות 1 לפני אחסון ב -20 ° C. FCS מופשר מסונן 0.2μm לפני השימוש. מערבבים את מרכיבי התרבות עם תאים ממוינים. שמור את התאים כל חצי מוצק רכיבי התקשורת על הקרח במהלך הכנת בכל עת כדי למנוע התמצקות שלMatrigel. כל ציוד אשר באים במגע עם Matrigel כולל, טיפים פיפטה, מזרקים ומחטים, צריך להיות קר. מקום אלה מספקת בשעה -20 ° C לפחות מחצית לפני השימוש. קבע את כמות התאים להיות seeded היטב לכל צלחת 24 באר. עד 25,000 תאים יכול להיות מצופה ל 24 גם כן. אפשר לבצע טיטרציה של צפיפות התאים בניסויים הראשונים כדי לקבוע את המספר האופטימלי תא זריעה. מוסיפים את מרכיבי התרבות לצינור קלקר 5 מ"ל עם מכסה לצלם ברצף שמתואר בטבלה 1 (לציין כי תאים מתווספים האחרון, כדי למנוע גירוי מוקדמת). מוסיפים את methylcellulose 3.3% ל הצינורות פוליסטירן הראשון התאים מיון האחרונים. שים לב כי הפתרון methylcellulose 3.3% צריך להיות משוכות והוסיף צינורות קלקר עם מחט מד ½ 16 ו מזרק סיים מסומן כראוי. באופן כללי, על מנת למדוד בצורה נכונה את עוצמת הקול של פתרונות צמיגה, כמו 3.3% methylcellulose סולution ואת תערובת תרבות הסופי, חשוב לשאוב כמה פתרון המזרק הראשון, ולאחר מכן מיד לדחוף את הפתרון כדי לגרש את האוויר. הפתרון methylcellulose 3.3% עשוי להיות מחומם לטמפרטורת החדר אם הוא קשה מדי להוציא. עם זאת, להבטיח שהוא מקורר על קרח אחרי זה הוא חילק לתוך צינורות פוליסטירן ולפני תוספת של Matrigel. צלחת חצי מוצק מדיה המכיל תאים ממוינים. לאחר הבטחת כמוסות של צינורות קלקר הן במקומו, לנער את הצינורות על ידי ידיים במרץ וביסודיות. בועות האוויר יופק במהלך תהליך זה. מניחים את הצינורות על קרח דק 5 או עד פני השטח בועות אוויר קטנות. השתמש מזרק עם מחט 1mL ½-16 מד ½ או 18 כדי לשאוב את תוכנו. בצע את העצות 3.6.2 לצייר נפח מדויק של פתרון צמיג ללא אוויר מזרקים. לאט לאט לוותר על 500 UL של מדיה לתוך כל 24 גם כן. להשתמשאת הקובץ המצורף נמוך 24 גם הצלחות בלבד. מוסיפים את המדיה ישירות למרכז הבאר. חצי מוצק מדיה באופן אוטומטי פרושים בבארות. עבור כל מדגם ניסיוני, בארות quadruplicated משמשים באופן שגרתי על מנת לקבל תוצאות מובהקות סטטיסטית. רק 4 העמודים הפנימיים של צלחת 24 גם בכיוון אופקי משמשים תרבות. מלאו את הבארות הנותרות עם מים סטריליים כדי לסייע humidification של התרבות התא המכיל את. דגירה התאים 37 ° C ו 5% 2 CO באוויר. עיכוב נוסף של גורמי גדילה. ניתן להוסיף גורמי גדילה לאחר תחילת התרבות. תמרונים אלה עשויים לשמש כתובת ההשפעות ההישרדות של גורמי גדילה מסויימים. גורם צמיחה פתרונות עד μL 100 גם יכול להיות נטף באמצעות מזרק 1 מ"ל עם 26 G 08/03 המחט מותר מפוזר לתוך חצי מוצק מדיה. 4. התבוננות במבנה המושבה תחת מיקרו אורלהתמודד תאים יש לשים לב מיד לאחר ציפוי על מנת להבטיח כי תאים בודדים הם באופן אקראי מופץ באופן שווה ברחבי את הבארות. אם רוב התאים או במושבות כתוצאה מופצים בשוליים של הבארות, זו עולה כי מחלק חצי מוצק מדיה לתוך הבארות היה חזק מדי (ראה סעיף 3.7.4). בשל צפיפות השפעה מושבה המניסקוס בשולי בארות התרבות עשוי להיות גבוה יותר בהשוואה לאלה המתגוררים במרכז. מספר המושבה כימות. בשל תכונה 3 מימדי של התקשורת, המושבות יופיעו מוקדים שונים. לפיכך, התאמה של המוקד עבור כל המושבה ייתכן שתידרש במהלך התצפית על ידי מיקרוסקופ אור. צרף רשת תחת 24 גם כאשר ספירת על מנת למנוע רישום המושבה פעמיים. ברשת ניתן להשיג על ידי חיתוך של הקיר petridish NUNC (קט No.169558). העדשה אובייקטיבי 10x על מיקרוסקופ אור יש להשתמש כדי observe ולספור המושבות. 5. נציג תוצאות: ניסויים קודמים הראו כי החל 2.5 x 10 5 תאים Murine ES R1 (בסך הכל 50 כלי התקשורת מ"ל) אפשר לצפות להפיק כ 5000 מתאים בגודל יום-6 EBS. Ngn3-EGFP תאים ES היו פחות יעיל; תאים 4 פעמים יותר נדרשו ליצור בגודל דומה EBS יום 6. בגלל 25 יום-6 EBS מכילים בממוצע 1.88 ± 0.67 x 10 5 תאים, 1 כ 37.6 x 10 6 תאים ניתן לקבל EBS 5000. במהלך התרבות התאים מצורף צפויים להרחיב 2.72 ± 0.32 לקפל. 1 לפיכך, 5000 יום 6 EBS תניב כ 100 x 10 6 תאים 16 יום לפני המיון. לאחר gating, Ngn3-EGFP תאים + ירכיבו כ -10% מהאוכלוסייה יום-16 תא הכולל (סעיף 2.2.5 פרוטוקול טקסט ואיור 3). דוגמה photomicrographs של אינסולין להביע מושבות שמקורם בתאי גזע עובריים Murine מוצגת באיור 4. מושבות אלה יש מורפולוגיה ייחודית; קטן (~ 6-10 מיקרומטר) מושבות עגולה עם תאים בודדים במושבות כי הם קטנים, כהים, לא אור רעיוני. בפרסום הקודם שלנו, חשפה 2 בזמן אמת RT-PCR ו מכתים immunofluorescent כפולה של מושבות בנפרד הרים יד הביטוי של אינסולין, C-peptide ו גלוקגון. תוצאות אלו מראות את היכולת של יחיד Ngn3-EGFP + לתאים להתמיין לתאי המכילים לפחות שני הורמונים איון בו זמנית, בדומה לגל הראשון פרימיטיבי כמו תאים האנדוקרינית. Assay מושבה עבור תאים בודדים מפוזרים מאפשר ללמוד אותם אבות שיש להם את היכולת ליזום התפשטות והבחנה במבחנה (איור 5). לפיכך, זהו assay כי ניתן למדוד את הפונקציה הפנימית של ובתאים נפרדים. אבות שיש להם את capability להפוך אינסולין להביע מושבות מכונים אינסולין להביע יחידות המושבה להרכיב (ICFUs) (איור 5). עקבי לרעיון Ngn3 סימני ובתאים אנדוקריני בלבלב בפיתוח, 5 Ngn3-EGFP +, אבל לא Ngn3-EGFP -. MES תאים תאים שמקורם באוכלוסיות מועשרים עבור ICFUs 2 עם זאת, התדירות של אבות אלה עדיין נמוך, כ 0.1% עד 0.6% מכלל האוכלוסייה + Ngn3-EGFP מבודד תרבות יום 16 הם ICFUs 2 בכל מקרה, הבדל ברור יעילות מושבה יוצרי צפוי, עם Ngn3-EGFP + תאים הגבוהה ביותר, ואחריה. תאים presorted, ואז Ngn3-EGFP – תאים. באיור 1. ציר הזמן של בידול בתוך תאים במבחנה ES Murine אל הלבלב, כמו בתאים. במשך דור (CM) מדיה מזגן, Murine ES cells מגדלים ההשעיה עם FCS 15% בששת הימים הראשונים עם מינונים ירידה של monothioglycerol (6.0 x 10 -3 M עבור היומיים הראשונים ו 6.0 x 10 -4 M במשך ארבעת הימים הבאים) ליצור EBS. יום-6 EBS (80-100 דולר היטב) מועברים לאחר מכן מצורף 6-גם מנות המכילות 15% נוקאאוט החלפת בסרום. 5% FCS ניתן להוסיף בין 60-10 ימים של תרבות לזרז את הקובץ המצורף של EBS. Nicotinamide, exendin-4 ו activin אנושי רקומביננטי βB מתווספים אז לכלי התקשורת ביום תרבות 13 (ראה סעיף 1.1). מדיה נאסף ביום 16 תרבות ובשלב זה הפכה התקשורת מותנה. יום 16 תאים ממוינים ואז מצופה לתוך חצי מוצק מדיה assay המושבה. באיור 2. Photomicrograph נציג של גופים יום-6 embryoid גדול הנגזר Murine בתאי גזע עובריים. יום אידיאלי-6 EBS לפחות 150 מיקרומטר קוטרeter יש מרכזים חשוך (חיצים). ביטוי מוקדם של אבי סמני הלבלב (כגון PDX-1 ו Sox9) מוגברת אלה EBS (מידע לא מוצג) 3. באיור 3. מיון השערים MES תא הנגזרות יום Ngn3-16-EGFP תאים להביע. (א) שערי פיזור פורוורד לצד, מעיד על גודל התא גרעיניות בהתאמה, לחסל הלא הסלולר פסולת. (ב) DAPI משמש לזיהוי תאים מתים, אשר יהיה מוכתם חיובי כאשר נרגש על 405-413 ננומטר פליטת מזוהה עם מסנן 450/40. (ג) רוחב פולס, רוחב הדופק פיזור אלקטרוניים קדימה, מגלה כפילויות, אשר צריך לחסל לפני שהם עברו סדרן תא הקרינה הופעל. (ד) gating של EGFP (ערוץ FL1) לעומת autofluorescence באמצעות יום 16 תאים קו בקרת הורים התא כגון TL1 (פאנל משמאל) מאיר הקרינה האמיתית וכך Ngn3-EGFP <sup> + אוכלוסיית תאים (פאנל מימין). (ה) החץ האדום הימני מראה ידנית משמרת של השער + EGFP ממש לפני מיון להגדיל את הפרדת תאים חיובי כוזב. בשני אירועים (ד) ו – (ה) הם מגודרת על בסיס אזורי (R1 – R3) מוצג (AC). איור 4. Photomicrographs נציג אינסולין להביע מושבות בתרבות מוצקים למחצה. מושבות מופצים באופן אקראי להופיע קטן וחשוך, ללא אור אשכולות רעיוני. מושבות הפרט יכול להיות מאוחר יותר assayed עבור ביטוי גנים וחלבונים על ידי RT-PCR ומנתח אימונוהיסטוכימיה, בהתאמה (לא מוצג, ראו וידאו). איור 5. Assay המושבה המאפשר הערכות תפקודית כמותי של ובתאים יחיד. ספירה של מושבות וכתוצאה מכך משמש כדי לחשב את frequency של ובתאים בין תאים מצופה מוחלט. הרכב של תאים בתוך כל מושבה מעיד על הפוטנציאל של אבי השושלת היוזם. שימוש זה assay, מצאנו כי Ngn3-EGFP + תאים שמקורם בתאי גזע עובריים Murine היו מועשר עבור אינסולין להביע המושבה להרכיב יחידות (ICFUs), ובתאים שיש להם את היכולת להתמיין אינסולין להביע המושבות 2. טבלה 1. חצי מוצק מדיה ותרבות רכיבים סדר תוספת.