Een kwantitatieve test voor insuline-expressie Kolonie-vormende voorouders

1. Differentiatie van muizen ES-cellen om alvleesklier-achtige cellen in vitro te geconditioneerde media (CM) te genereren voor de kolonie assay Procedures voor muizen ES-cel onderhoud, hebben embryoid lichaam (EB) vorming in suspensie cultuur, en gehechtheid cultuur voor verdere differentiatie eerder beschreven 1-3 en zijn niet de focus van dit rapport. Een schematische voorstelling van de stappen die betrokken zijn bij onze differentiatie protocol is weergegeven in figuur 1. Voor het verkrijgen van hoge kwaliteit geconditioneerde media, is het belangrijk om eerst het genereren van zes-dagen-oude EBS waarin ten minste 30-40% van hen zijn met een diameter van minstens 150 um. De grotere EBS moet bevatten donkere vlekken onder de lichtmicroscoop, hetgeen duidt op grotere differentiatie (figuur 2). Selectie van hoge kwaliteit foetaal kalf serum (FCS) is van cruciaal belang om dergelijke EBS te genereren. Hoge kwaliteit FCS kavels geselecteerd op basis van hun vermogen om de ondersteuning van differentiation van de EBS de richting van insuline 1, glucagon en amylase 2A genexpressie in de latere stadia (dag 18-20) zoals gedetecteerd door RT-PCR-analyse. Bovendien, als dag-6 EBS worden overgebracht van opschorting cultuur tot cultuur beslag (ongeveer 80 tot 100 EBS per putje in 6 well platen) is het belangrijk om voorzichtig te draaien de platen van de dag-6 EBS verzamelen in het midden van de putten. Om onbekende redenen, manoeuvres die cel-cel contacten leiden tot een betere ontwikkeling van de pancreas-achtige cellen van EBS in de volgende bijlage cultuur stadium te verbeteren. Op cultuur dag 13, vervangt u de attachment cultuur media (DMEM/F-12 (1:1), 15% knock-out serum vervanging, 2 mM L-glutamine, 50 U / ml penicilline, 50 ug / ml streptomycine) met vers beslag cultuur media containing10 mM nicotinamide, 0,1 nM exendin-4, en 10 ng / ml humaan recombinant activine SSB (alle concentraties zijn definitief). Op cultuur dag 16, het verzamelen van de media uit stap 1.1 en filter het door een 0,2 um polyethersulfone membraan. Vanaf dit punt de verzamelde media worden aangeduid als geconditioneerde media (CM). Aliquot de CM in 15 ml Falcon buizen en het bewaren bij -80 ° C tot vlak voor het semi-vaste cultuur (zie hoofdstuk 3 hieronder). 2. Het verkrijgen van de pancreas-achtige voorouders in enkele celsuspensie met behulp van een fluorescentie-geactiveerde cel sorteerder Een knock-in muizen ES-cellijn, 4 aangewezen als Ngn3-EGFP, waar de EGFP reportergen vervangen een allel van de Ngn3 locus werd gedifferentieerd zoals eerder beschreven. Ngn3 2 is een basic helix-loop-helix (bHLH) met transcriptiefactor . uitgedrukt door de alvleesklier endocriene voorouders tijdens de ontwikkeling vijf Dag-16 culturen werden normaal gesproken gesorteerd naar gedifferentieerde Ngn3-EGFP + en Ngn3-EGFP te krijgen -. cellen 1,2 Dissociatie van gedifferentieerde cellen in een enkele celsuspensie. Incubeer dag-16 culturen wiste 0,25% trypsine-EDTA (3 min, 37 ° C) om de cellen van cultuur putten te verwijderen. Voeg 10% FCS tot trypsine-activiteit te stoppen. Was de cellen met magnesium en calcium-vrij fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% bovine serum albumine (BSA), en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en incubeer de cel klonten met 4 mg / ml collagenase B en 2000 U / mL deoxyribonuclease (DNase) I (30 min, 37 ° C) tot een enkele celsuspensie te produceren. Gebruik een 1000 ui pipet te verstoren de cel pellets elke 10 minuten naar de dissociatie proces versnellen. Was de cellen met PBS met 0,1% BSA, en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer de cellen in PBS met 0,1% BSA. De voorbereiding van de cellen voor het sorteren. Voeg 2 ul DNase I (1 MU / mL) voor iedere ml celsuspensie naar cel reaggregation te voorkomen tijdens het sorteren. Passeer de enkele celsuspensie door middel van een 40 tot 70 pm mesh te grote cel aggregaten te verwijderen. Voeg DAPI (1 pg / ml uiteindelijke concentratie) op de enkele celsuspensie. Verwerven flowcytometrie gegevens op een cel sorter. Een MoFlo MLS (Beckman Coulter) celsorteerder werd gebruikt voor dit rapport. Gating van celpopulaties voor het sorteren. Ngn3-EGFP + en Ngn3-EGFP – cellen zijn gated eerste met voorwaartse verstrooiing versus zijwaartse verstrooiing (Figuur 3A), gevolgd door DAPI vs zijwaartse verstrooiing (Figuur 3B), pulsbreedte vs zijwaartse verstrooiing (Figuur 3C), en tenslotte FL1 vs auto-fluorescentie (Figuur 3D). De laatste soort poort van Ngn3-EGFP + cellen is met opzet naar rechts (figuur 3E, pijl) om de besmetting van Ngn3-EGFP limiet – cellen tijdens het sorteren. Voor de negatieve controle gating, zowel dag-6 EBS uit Ngn3-EGFP ES lijn of in hetzelfde stadium, dag-16 cultuur van een niet-transgene lijn, zoals TL1 ES-cellen (Figuur 3D, linker paneel), kunnen worden gebruikt. Sorteer Ngn3-EGFP + en Ngn3-EGFP <sup> – cellen. 3. Plating gesorteerd cellen om semi-vaste cultuur Matrigel voorbereiding. Aliquot de Matrigel tot 1 ml per tube en bewaar bij -20 ° C voor gebruik. Bevroren monsters moeten worden geplaatst bij 4 ° C gedurende de nacht of op ijs gedurende 3 uur tot vlak voor ontdooien voor gebruik. Ontdooide monsters moet blijven op het ijs tijdens de semi-vaste cultuur voorbereiding op resolidification te voorkomen. Methylcellulose-oplossing (3,3%) voorbereiding. Methylcellulose poeder kan niet worden geautoclaveerd. Om de bacterie-vrij methylcellulose oplossing te verkrijgen, gebruik schone weegschuitjes en geautoclaveerd roer bars, bekers, kolven en andere hardware tijdens de bereiding proces. Een dag voor de methylcellulose-oplossing bereiden, op te slaan 200 ml steriel dubbel gedestilleerd water bij 4 ° C. Ook bereiden 500 ml 2x DMEM/F12 media (voor te bereiden door het oplossen van poedervormige DMEM / F-12 in dubbel gedistilleerd water) met 100 U / ml penicilline en100 ug / ml streptomycine en bewaar bij 4 ° C. Op de dag van de methylcellulose voorbereiding, voeg 500 ml steriel dubbel gedestilleerd water tot een 1000 ml glazen beker met een stuk aluminiumfolie op de top. Kook gedurende minstens 30 minuten om het water van de luchtbellen te ontdoen. Leg een groot formaat roerstaafje (minstens 3 centimeter in lengte) in een 2000 ml glazen fles. Meet 300 ml kokend water toe en breng het naar de kolf. Plaats de kolf op een roer plaat (zonder verwarming). Langzaam roeren het hete water om te voorkomen dat het genereren van luchtbellen. Wegen 33 gram methylcellulose poeder en heel langzaam toe te voegen aan het hete water. Heet water is nodig om de methylcellulose poeder efficiënt nat en de daaropvolgende ontbinding in koude temperaturen hulp. Blijf roeren tot het poeder van de temperatuur wordt verlaagd tot ongeveer 40-45 ° C. Voeg de 200 ml koud steriel dubbel gedestilleerd water aan de koeling methylcellulose mengsel. Onmiddellijkna, moet je beginnen om te zien de oplossing turn transparante en visceuze, wat aangeeft dat methylcellulose is op te lossen in de waterige fase. Hand zwenk de kolf aan de oplossing zorgen wordt grondig gemengd. Voeg de 500 ml koud 2x DMEM/F12 media. Blijf swirl met de hand om te mengen. Plaats de kolf op een roer plaat in een koude kamer, en langzaam de methylcellulose-oplossing roeren gedurende 24-48 uur. Aliquot de oplossing in 125 ml per flesje, en bewaar bij -20 ° C. Een monster moet worden overgebracht in een steriele petrischaal en geplaatst in 37 ° C incubator tot steriliteit te testen. Ontdooid methylcellulose-oplossing kan worden bewaard in de koelkast voor maximaal 2 maanden. Geconditioneerde media voorbereiding. Dooi CM (zie hoofdstuk 1) vlak voor het gebruik. Houd de CM op ijs in heel semi-vaste cultuur voorbereiding. Bereid de volgende groeifactoren: 1,0 M nicotinamide, 0,1 uM exendin-4, 10 ug / ml recombinant humaan activine βB, en 10 & mU; g / mL VEGF-A. Bewaar de nicotinamide en exendin-4 bij -20 ° C en activine βB en VEGF-A bij -80 ° C, en onmiddellijk ontdooien ze voor gebruik. Alle semi-vaste kweekmedia componenten moeten worden gehouden op ijs tijdens de plating. Dient te worden opgemerkt dat de toevoeging van VEGF-A later werd gevonden niet noodzakelijk voor kolonievorming. 2 Foetaal kalf serum voorbereiding. FCS moeten hitte geïnactiveerd alvorens te gebruiken. Incubeer de FCS gedurende 30 minuten bij 56 ° C in een waterbad aan te vullen eiwitten te inactiveren. Als de eerste FCS voorraad fles bevat meer dan 500 ml aliquot het in 125 ml flesjes. Het grotere oppervlak zal zorgen voor een gelijkmatige en grondig verwarming van het hele volume. Laat de flessen bij kamertemperatuur afkoelen ten minste 1 uur voor de opslag bij -20 ° C. Ontdooid FCS is 0.2μm gefilterd voor gebruik. Meng cultuur componenten met gesorteerde cellen. Houd de cellen en alle semi-vaste media componenten op ijs tijdens de bereiding te allen tijde voorkomen dat stolling vanMatrigel. Alle leveringen die in contact komen met Matrigel met inbegrip van, moet pipetpunten, spuiten en naalden, koud zijn. Plaats deze voorraden bij -20 ° C minstens een half uur voor gebruik. Bepaal de hoeveelheid cellen per putje worden uitgezaaid in een 24-well plaat. Tot 25.000 cellen kunnen worden verguld per 24-well. Men zou het uitvoeren van een titratie van celdichtheid in de initiële experimenten om de optimale zaaien het aantal cellen te bepalen. Voeg de cultuur van componenten tot een 5 mL polystyreen buis met een snap cap in de volgorde zoals beschreven in tabel 1 (merk op dat de cellen worden toegevoegd laatste om een ​​voortijdige stimulatie te vermijden). Voeg de 3,3% methylcellulose aan de polystyreen buizen eerste en de gesorteerde cellen laatste. Merk op dat de 3,3% methylcellulose-oplossing dient te worden opgesteld en toegevoegd aan de polystyreen buizen met een 16 ½ gauge naald en een adequaat gemarkeerd afgestudeerd spuit. In het algemeen, om correct te meten van het volume van viskeuze oplossingen, zoals de 3,3% methylcellulose solution en het uiteindelijke mengsel cultuur, is het belangrijk om een ​​oplossing te zuigen in de spuit eerste, en daarna meteen druk de oplossing uit om de lucht te verdrijven. De 3,3% methylcellulose-oplossing kan worden opgewarmd tot kamertemperatuur als het te moeilijk om te tekenen uit. Echter, zorgen dat het gekoeld op ijs nadat het wordt afgeleverd in het polystyreen buizen en vóór de toevoeging van Matrigel. Het bord van de semi-vaste media met gesorteerde cellen. Na het waarborgen van de doppen van de polystyreen buizen worden stevig op hun plaats, schud de buizen door de handen krachtig en grondig. Luchtbellen zullen worden gegenereerd tijdens dit proces. Plaats de buisjes op ijs gedurende 5 minuten of tot de kleine luchtbelletjes het oppervlak. Gebruik een 1 ml spuit met een 16 ½ of 18 ½-gauge naald om de inhoud te zuigen. Volg de aanwijzingen in 3.6.2 tot en nauwkeurige volume van de viskeuze oplossing te trekken zonder dat de lucht in spuiten. Langzaam afzien van 500 uL van de media in elke 24-well. Gebruikde lage attachment 24-well platen alleen. Direct toe te voegen in de media naar het midden van de put. De semi-vaste media wordt automatisch verspreid in de putten. Voor elke experimentele sample, zijn quadruplicated putten routinematig gebruikt om statistisch significante resultaten te verkrijgen. Alleen de vier binnenste kolommen van een horizontaal georiënteerde 24-wells plaat worden gebruikt voor cultuur. Vul de overige wells met steriel water om bevochtiging van de cel-bevattende cultuur hulp. Incubeer de cellen in 37 ° C en 5% CO 2 de lucht. Vertraagde toevoeging van groeifactoren. Het is mogelijk om groeifactoren toe te voegen na de inleiding van de cultuur. Dergelijke manoeuvres kunnen worden gebruikt om het voortbestaan ​​effecten van bepaalde groeifactoren te pakken. Groeifactor oplossingen tot 100 ul per putje kan worden droop via een 1 ml spuit met een 26 G 3 / 8 naald en mogen diffunderen in de semi-vaste media. 4. Observeren kolonie formatie onder het licht micro'shet hoofd te bieden De cellen moeten in acht worden genomen onmiddellijk na plating om ervoor te zorgen dat de afzonderlijke cellen willekeurig en gelijkmatig verdeeld over de putten. Als de meeste van de cellen of de resulterende kolonies worden verdeeld aan de rand van de putten, zal dit erop wijzen dat het afgeven van de semi-solid media in de putten was te krachtig (zie paragraaf 3.7.4). Als gevolg van de meniscus effect kolonie dichtheid in de marge van de cultuur putten kan hoger zijn vergeleken met die die in het centrum. Kolonie nummer kwantificering. Door de 3-dimensionale functie van de media, zal de kolonies verschijnen op verschillende brandpunten. Zo kan een aanpassing van de focus voor elke kolonie nodig zijn tijdens observatie door lichtmicroscopie. Bevestig een net onder de 24-well bij het tellen, om te voorkomen dat het registreren van dezelfde kolonie twee keer. Een raster kan worden verkregen door het snijden van de wand van een NUNC petrischaal (Cat. No.169558). Een 10x objectief op een lichtmicroscoop moet worden gebruikt om observe en de kolonies. 5. Representatieve resultaten: Eerdere experimenten was gebleken dat, beginnend met 2,5 x 10 5 murine R1 ES-cellen (in 50 ml media in totaal) kan men verwachten dat circa 5.000 juiste maat dag-6 EBS te genereren. De Ngn3-EGFP ES-cellen minder efficiënt waren, 4 maal meer cellen werden verplicht om vergelijkbare omvang EBS te genereren door de dag 6. Omdat de 25 dagen-6 EBS bevat een gemiddelde van 1,88 ± 0,67 x 10 5 cellen, een van ongeveer 37,6 x 10 6 cellen kunnen worden verkregen uit 5000 EBS. Tijdens bevestiging cultuur van de cellen zullen naar verwachting 2,72 ± 0,32 vouwen uit te breiden. 1 dus 5000 dagen-6 EBS zal ongeveer 100 x 10 6 dagen-16 cellen opleveren vóór sortering. Na de gating, zal de Ngn3-EGFP + cellen maken ongeveer 10% van de totale dag-16 celpopulatie (Protocol Tekst paragraaf 2.2.5 en figuur 3). Voorbeeld van de photomicrographs van insuline-expressie kolonies afgeleid van muriene embryonale stamcellen is weergegeven in Figuur 4. Deze kolonies hebben een kenmerkende morfologie, klein (~ 60 tot 100 micrometer) ronde kolonies met individuele cellen in de kolonies die klein, donker, en geen licht reflecterend. In onze vorige publicatie, twee real-time RT-PCR en dubbele immunofluorescentie kleuring van individueel met de hand geplukt kolonies onthulde uiting van insuline, C-peptide en glucagon. Deze resultaten tonen het vermogen van een Ngn3-EGFP + cellen zich differentiëren naar cellen met ten minste twee eilandje hormonen tegelijk, lijkt primitief eerste golf zoals endocriene cellen. De kolonie test voor verspreid enkele cellen in staat stelt de studie voor de voorlopers die het vermogen tot proliferatie en differentiatie in vitro (figuur 5) in te leiden hebben. Dit is dus een test waarmee de intrinsieke functie van individuele stamcellen kunnen meten. De voorouders die de capabi hebbenteit van het worden insuline-expressie kolonies worden genoemd insuline-expressie kolonievormende eenheden (ICFUs) (figuur 5). Consistent met het idee dat Ngn3 merken endocriene progenitor cellen in de alvleesklier de ontwikkeling, 5 Ngn3-EGFP +, maar niet Ngn3-EGFP -. Cellen van MES cel afkomstige populaties zijn verrijkt voor de ICFUs 2 Echter, de frequentie van deze voorouders nog steeds laag, ongeveer 0,1% tot 0,6% van het totaal Ngn3-EGFP + populatie geïsoleerd van 16 dagen cultuur zijn ICFUs 2 Hoe dan ook, een duidelijk verschil in kolonievormende rendement wordt verwacht, met Ngn3-EGFP +-cellen het hoogste, gevolgd door de. voorgesorteerde cellen, en vervolgens de Ngn3-EGFP – cellen. Figuur 1. Tijdlijn van in vitro muizen ES-cellen differentiatie naar alvleesklier-achtige cellen. Voor de geconditioneerde media (CM) generatie, muizen ES cells worden gekweekt in suspensie met 15% FCS voor de eerste zes dagen met afnemende doseringen van monothioglycerol (6,0 x 10 -3 M voor de eerste twee dagen en 6,0 x 10 -4 M voor de volgende vier dagen) om EBS te genereren. Dag-6 EBS (80-100 per well) worden vervolgens overgebracht naar bijlage 6-well platen met 15% knock-out serum vervanging. 5% FCS kan worden toegevoegd tussen dag 6-10 van de cultuur naar de bijlage van de EBS te bespoedigen. Nicotinamide, zijn exendin-4, en menselijke recombinant activine βB vervolgens toegevoegd aan de media inzake cultuur dag 13 (zie paragraaf 1.1). Media is verzameld op cultuur dag 16 en op dit punt is geworden geconditioneerde media. Dag 16 cellen worden vervolgens gesorteerd en uitgeplaat in semi-vaste media voor assay kolonie. Figuur 2. Vertegenwoordiger microfoto van de grote dag-6 embryoid lichamen afgeleid van muriene embryonale stamcellen. Ideale dag-6 EBS zijn ten minste 150 micrometer in diametereter en hebben verduisterd centra (pijlen). Expressie van de vroege pancreas voorlopercellen markers (zoals de PDX-1 en Sox9) is verbeterd in deze EBS (gegevens niet getoond). 3 Figuur 3. Sorteren poorten voor MES cel afkomstige dag-16 Ngn3-EGFP tot expressie brengen. (A) Voorwaarts en zijwaartse verstrooiing poorten, indicatief van cel grootte en de granulariteit respectievelijk te elimineren niet-cellulaire puin. (B) DAPI wordt gebruikt om dode cellen, die zal worden gebeitst positief als opgewonden bij 405-413 nm en emissie gedetecteerd met een 450/40 filter te identificeren. (C) Pulse breedte, de breedte van de elektronische voorwaartse verstrooiing pols, onthult wambuizen, die moet worden weggenomen voordat ze worden doorgegeven door de fluorescentie geactiveerde cel sorteerder. (D) Poortsignalen van EGFP (kanaal FL1) versus autofluorescentie met behulp van dag-16 cellen van een controle ouder cellijn, zoals TL1 (linker paneel) brandt ware fluorescentie en dus ook de Ngn3-EGFP <sup> + celpopulatie (rechter paneel). (E) Rode pijl toont handleiding rechts-shift van EGFP + gate vlak voor het sorteren tot scheiding van vals-positieve cellen te verhogen. Evenementen in beide (D) en (E) zijn gated gebaseerd op regio's (R1 – R3) getoond in (AC). Figuur 4. Vertegenwoordiger microfoto's van de insuline-expressie kolonies in semi-solid cultuur. Kolonies worden willekeurig verdeeld en worden weergegeven als kleine donkere, niet-reflecterende licht clusters. Individuele kolonies kunnen later worden getest op gen-en eiwitexpressie door RT-PCR en immunohistochemie analyses, respectievelijk (niet afgebeeld, zie video). Figuur 5. Een kolonie assay dat functionele en kwantitatieve evaluatie van enkele progenitorcellen mogelijk maakt. Nummering van de resulterende kolonies wordt gebruikt om de freq te berekenenuency van de progenitorcellen in het totale vergulde cellen. De samenstelling van de cellen in elke kolonie is een indicatie van de lijn potentieel van de initiërende stamvader. Met behulp van deze test, vonden we dat Ngn3-EGFP + cellen afgeleid van muriene embryonale stamcellen werden verrijkt voor insuline-expressie kolonievormende eenheden (ICFUs), progenitor cellen die de mogelijkheid om te differentiëren naar zijn insuline-expressie kolonies. 2 Tabel 1. Semi-solid Cultuur Media-onderdelen en volgorde van toevoeging.