Трансфекции и Nucleofecting человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Наш протокол начинается с метода адаптации человека ИПСК фидерными без культуры, а затем протоколы для трансфекции ИПСК человека использования GeneJuice (EMD) и nucleofection из человеческих ИПСК использовании устройства AMAXA nuclefector. Примечание: Следующие процедуры выполняются в стерильных ламинаре. Все средства массовой информации и решений уравновешивают до 37 ° С или при комнатной температуре, прежде чем начать, если не указано иное. 1. Создание ИПСК человека на фидерной системы свободного ИПСК человека ранее поддерживали на фидерных клеток может быть разделена, переносится на Geltrex покрытием блюдо и выдерживают в течение двух местах до подачи без трансфекции. Оттепель Geltrex течение ночи при 4 ° C. Для подготовки Geltrex покрытие, разбавленные размороженные Geltrex 1:50 в холодном DMEM. Смешать решения мягко. Примечание: Geltrex, как Matrigel является растворимой формы подвале MATR мембраныIX очищенный от мышиного Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) опухолевых клеток. Кроме того, Matrigel можно использовать в качестве внеклеточного матрикса установить подачи свободного человека ИПСК культур. Покройте всю поверхность культуры скважин с Geltrex раствор (1 мл для 35-мм хорошо). Пальто скважин с Geltrex при 37 ° C инкубаторе в течение 1 часа. Для прохождения ИПСК человека, добавляют 1 мл accutase на лунку и инкубировать при 37 ° С в течение 1 мин, пока большинство клетки начинают отделяться. Для прохождения ИПСК человека, добавляют 1 мл accutase на лунку и инкубировать при 37 ° С в течение 1 мин, пока большинство клетки начинают отделяться. Добавить 10-15 стеклянных бус к клеткам и осторожно поворачивайте тарелку. Добавить 2 мл KnockOut DMEM / F12 и нежно растереть. Передача клеточной суспензии в 10 мл центрифужные пробирки. Побочные клеток на 800 оборотов в минуту в течение 3 минут при комнатной температуре. Супернатант из трубы, оставляя человека ИПСК гранул нетронутыми. Аккуратно вылить трубыдисперсных осадок клеток. Удалить Geltrex с покрытием хорошо. Аккуратно ресуспендирования человека ИПСК гранул в соответствующем объеме STEMPRO. Распределить между скважинами фидеров, в зависимости от скорости пролиферации). ИПСК человека можно пассировать в расколе соотношении от 1:2 до 1:6. Аккуратно поместите в 5% СО 2 инкубатора, вихрем пластины тщательно, чтобы гарантировать равномерное распределение клеток по скважинам. Поток клетки ежедневно, пока клетки готовы быть разделена еще раз (когда клетки достигают 80% слияния). Прохождение человека ИПСК на новые Geltrex покрытием хорошо (шаг 1,3 до 1,9) в расколе соотношении 1:2. Малый колонии должны быть сформированы и распределены равномерно на Geltrex покрытием и до трансфекции. 2. Трансфекция человека ИПСК с GeneJuice Cells (выросла на 6-луночные планшеты) должно быть примерно 40 -50% сливающийся в день трансфекции для достижения оптимальной эффективности трансфекции. ЭтоНет необходимости менять клеточной среде до следующего дня. Подготовка 100 мкл KO-DMEM/F12 в стерильный 1,5 мл трубки Эппендорф. Добавить 27 мкл реагента трансфекции GeneJuice. Все хорошо перемешать. Выдержите при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавить 4 мкг плазмидной ДНК. Выдержите трубки при комнатной температуре в течение 15 мин. Выбор плазмида имеет решающее значение для оптимальной эффективности трансфекции. Мы используем плазмиды с повышенной зеленой флуоресценции (EGFP) обусловлен CAG промоутер 5 (pCAG-EGFP). CAG промоутер сильный промотор, который транскрипционно активное участие в ИПСК человека и поэтому может быть использован для экспрессии трансгенов в этих клетках. В наших руках, линеаризации плазмиды, похоже, не влияет на эффективность трансфекции. Добавить GeneJuice-смесь ДНК в клетки и вращать пластину. Побочные пластины при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут (метод "spinoculation"), чтобы увеличить контакт трансфекции смеси с человека ИПСК на скважине. Инкубируйте клетки при 37 иградусов, в течение ночи. Монитор для эффективности трансфекции на следующий день. Для стабильной трансфекции, изменение средней следующий день с новыми STEMPRO. Добавить соответствующий антибиотик выбора после 24 – 48 часов. 3. Nucleofection из ИПСК человека ИПСК человека, выращенных на фидеры или Geltrex может быть использован для nucleofection. Тем не менее, мы настоятельно рекомендуем replating nucleofected человека ИПСК на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) или человеческие фибробласты крайней плоти (HFF) питатели для обеспечения высокой жизнеспособности клеток и восстановление. По крайней мере 2 миллиона клеток должны быть использованы для достижения более высокой выживаемости клеток после nucleofection. Подготовка фидерной ячейки кондиционированных сред (СМ) путем инкубации человека ИПСК KnockOut Сыворотка Замена (KOSR) средах с фидерных клеток в течение ночи. Сбор CM каждые 24 часов. Примечание: Любые мыши штамма используют для приготовления подачи слоев (например, BLK6, CF1 и MF1) подходит для использования FOГ решений CM. В день nucleofection, предварительно лечить человека ИПСК с 10 мкМ ингибитора ROCK минимум на 1 час. Подготовьте 82 мкл человеческого решение клетки стволовые nucleofector в стерильный 1,5 мл трубки Эппендорф. Добавить 18 мкл дополнения 1. Все хорошо перемешать. Инкубируйте раствора при 37 ° С в течение 5 мин. Предварительно теплой подачи клетки-кондиционированной среды (CM) и 0,25% трипсин / ЭДТА до 37 ° C. Под капотом, prelabel один стерильные 15 мл коническую трубку. Осторожно снимите средств массовой информации из ИПСК человека культуры, который будет nucleofected. Осторожно промыть клетки с 2 мл 1X фосфатным буферным раствором (PBS) на лунку. Аспирируйте PBS. Добавить 1 мл 0,25% трипсина на лунку. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 3 минут. Аккуратно растереть клетки с 1000 кончиком пипетки мл. Вымойте дно колодца, чтобы убедиться, что все человеческие ИПСК полностью снята. Передача клеточной суспензии с меченым 15 мл коническую трубку. Примечание: трипсинизации в одну слоктей должны строго избегать. Клетки должны быть смещены только на небольшие скопления клеток состояла примерно из тройки клеток. Малый скопления клеток (клетки троек) будет распадается на отдельные клетки во время последующей обработки клеток. Добавить MEF 9 мл среды для инактивации трипсина. Побочные клеток на 800 оборотов в минуту в течение 3 минут. Осторожно аспирации супернатант и оставить осадок клеток неповрежденной. Ресуспендируют клеток в предварительно нагретой 100 мкл человеческих стволовых клеток nucleofector решение, начиная с шага 3.3. Передача клетки nucleofector кюветы, используя 1 мл пипетки. Добавить 4 мкг плазмидной ДНК в клеточной суспензии в кювете. Смешать клеток и ДНК, закрученной нежный. Нажмите кювет дважды на капот поверхности. Вставьте кювету в держатель nucleofector. Использование программы B-016. Nucleofect клетки, нажав на кнопку X. < > Будет отображаться, когда nucleofection процесса завершенаред (как правило, занимает всего 1-5 секунды). Использование других программ nucleofection (A-023, A-033 и U-023) дали менее 10% от EGFP-положительных клеток из человеческих ИПСК. Получить nucleofected клеток из кюветы, используя предоставленные Пастера пластиковые пипетки. Восстановление клеток ресуспендирования их в предварительно нагретой CM-и рок-ингибитора в стерильный 1,5 мл трубки Эппендорф. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 10 минут, чтобы позволить клеткам восстановиться. Передача клетки каплям на фидер слои с помощью 1 мл пипетки. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение ночи. Монитор для эффективности трансфекции на следующий день. Для получения стабильных клонов трансгенных человека ИПСК, что стабильно экспрессирующих трансген, изменение средней на следующий день с CM-и рок-ингибитором. Добавить соответствующий антибиотик выбора после 24 – 48 часов. 4. Представитель Результаты: <stРонг> Рисунок 1. Микрофотографии Riv1 человека ИПСК трансфицировали pCAG-EGFP. (A) УЗФБ-экспрессирующих клеток, трансфицированных Riv1 использованием GeneJuice на Geltrex 12 часов после трансфекции. Колонии Riv1 человека ИПСК покрытием и сформированы на фидеры после nucleofection использованием B-016 (B) и A-023 (C) программы. (D) Стабильно EGFP-выражения человеческих колоний ИПСК с повсеместным выражение УЗФБ, полученные из GeneJuice. (E) Стабильно трансфицированные Riv1 человека ИПСК сохранил конститутивной экспрессии УЗФБ во время эмбриоидных дифференциация тела.