人类诱导多能干细胞的转染和Nucleofecting

我们的协议，开始与人类iPSCs的方法，以适应无饲养层培养，GeneJuice（EMD）和人类iPSCs使用Amaxa公司nuclefector设备的核转染转染人类iPSCs的协议。 注：下列程序进行，在无菌层流罩。所有的媒体和解决方案是平衡至37℃或室温，然后再启动，除非另有规定。 1。馈线系统上建立人类iPSCs 人类iPSCs可以保持原来的饲养层细胞分裂，转移到Geltrex涂层的菜和维护馈线转染前两个通道。 在4°C过夜解冻Geltrex要准备Geltrex涂料，冷DMEM的解冻Geltrex 1:50稀释。混合轻轻的解决方案。 注：Geltrex，类似基底膜是可溶形式的基底膜MATR九纯化Engelbreth – 霍尔姆群（EHS）从小鼠肿瘤细胞。或者，基底膜可以用作一种细胞外基质，建立人类无馈线IPSC的文化。 覆盖培养孔与Geltrex溶液（1毫升，35毫米）的整个表面上。外套井Geltrex在37℃培养箱中培养1小时。 要通过人类iPSCs，1毫升的accutase中，每孔置于37°C 1分钟，直到大部分细胞开始分离。 要通过人类iPSCs，1毫升的accutase中，每孔置于37°C 1分钟，直到大部分细胞开始分离。 将添加10-15玻璃珠的细胞，轻轻地旋转板。加入2毫升的淘汰赛DMEM / F12，轻轻捣碎。细胞悬浮液转移到10毫升离心管中。 附带细胞以800rpm的转速在室温下3分钟。 吸液管从上清液，留下人类IPSC的颗粒完好无损。轻轻一抖管，分散细胞沉淀。 从涂好删除Geltrex。 轻轻重悬人类IPSC的颗粒在适当体积的STEMPRO。分发井间的进料器，取决于增殖率）。人类iPS细胞可以传代的分路比为1:2到1:6。 小心地放入5％CO 2培养箱中，涡流板仔细横跨孔中的细胞，以确保均匀分布。 饲料，直到细胞的细胞每天都准备好再次被分裂（当细胞达到80％融合）。 流路到新的Geltrex涂覆以及人类iPSCs（步骤1.3到1.9）中的分流比为1:2。小菌落形成上Geltrex转染前涂好且分布均匀。 2。 GeneJuice转染的人类iPSCs 细胞（6孔板上生长）应该是约40 -50％汇合的转染当天，以达到最佳的转染效率。这是没有必要改变的细胞培养基中，直到第二天。 准备的100微升KO-DMEM/F12在无菌的1.5毫升微量离心管。加入27微升GeneJuice转染试剂。拌匀。在室温下孵育5分钟。 加入4μg质粒DNA。管，在室温下孵育15分钟。质粒的选择是至关重要的最佳的转染效率。我们使用的质粒与CAG启动子5（pCAG-eGFP的）驱动的增强型绿色荧光蛋白（eGFP）。 CAG启动子是一个强启动子的转录活性在人类iPSCs，并因此可以被用来驱动在这些细胞中的转基因表达。在我们的手中，线性化的质粒转染效率似乎并没有影响。 加入GeneJuice-DNA混合物的细胞和旋流板。旋转板，在1200 rpm离心5分钟（'spinoculation'方法），以增加接触就做好了人类iPSCs转染混合物。 培养细胞在37及度C过夜。 监测转染效率的第二天。 对于稳定转染，改变介质的第二天与新鲜STEMPRO。 24 – 48小时后，加入适当的抗生素选择。 3。核转染的人类iPSCs 馈线或Geltrex上生长的人类iPSCs可以使用核转染。然而，我们强烈建议replating，nucleofected人类iPSCs到小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），人包皮成纤维细胞（HFF）馈线，以确保高细胞活力和恢复。应使用至少2百万个细胞，以实现更高的后核转染的细胞的存活。 准备饲养层细胞的条件培养基（CM）培育人类iPSC的Knockout血清的更换（KOSR）的媒体与饲养层细胞过夜。收集CM，每24小时。 注：任何用于制备饲养层（如BLK6，CF1和MF1）的小鼠品系是适合用于R在CM。 核转染的当天，预治疗人类iPSCs用10μMROCK抑制剂至少为1小时。 准备人类干细胞nucleofector溶液的82μl的在无菌的1.5毫升微量离心管中。加入18微升补充1。拌匀。溶液在37℃下孵育5分钟。 预温暖的饲养细胞的条件培养基（CM）和0.25％胰蛋白酶/ EDTA至37℃。引擎盖下，prelabel 1无菌15毫升锥形管。 小心地取出媒体从人类iPSC的文化被nucleofected。轻轻洗2毫升1X磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，每孔细胞。吸取PBS。 0.25％胰蛋白酶，每孔加入1 ml。细胞在37℃下孵育3分钟。 细胞用1000毫升移液管尖轻轻捣碎。洗井的底部，以确保所有人类iPSCs完全脱离。细胞悬浮液转移到标记的15毫升锥形管。 注：胰酶消化成单个C英语学习者应严格避免。细胞应该只被抛下小由约三胞胎细胞组成的细胞团块，。在随后的处理的细胞小的细胞团块（小区三元组），将解离成单细胞。 加9毫升的MEF媒体灭活胰蛋白酶。附带细胞以800rpm，3分钟。小心吸出上清液，并留下细胞沉淀完好。 重悬细胞预热100μl的人干细胞nucleofector的解决方案，从步骤3.3。 将细胞转移到一个nucleofector的比色皿，用1毫升移液管尖端部。 到试管中的细胞悬浮液中加入4μg质粒DNA。细胞和DNA混合，轻轻回荡。轻按两次比色皿的引擎盖上表面。 将试管中到nucleofector持有人。方案B-016。 Nucleofect细胞按按钮X. < >时，将显示的核转染过程是COMPLET的ED（通常只需要1-5秒）。使用其他核转染方案的（A-023，A-033和U-023），得到小于10％的从​​人类iPSCs的eGFP阳性细胞。 从试管中使用所提供的巴斯德塑料吸管检索nucleofected细胞。恢复细胞，再悬浮到无菌的1.5毫升微量离心管中预热的CM和ROCK抑制剂。 10分钟，在37°C培养细胞，让细胞恢复。 逐滴传递细胞的饲养层上使用1毫升的移液枪枪头。孵育细胞于37℃培养过夜。 监测转染效率的第二天。为了获得稳定的转基因人类iPSCs克隆稳定表达的转基因，改变介质的第二天，CM和ROCK抑制剂。 24 – 48小时后，加入适当的抗生素选择。 4。代表性的成果： <st荣图1。的RIV1人类iPSCs与pCAG-EGFP转染的显微照片。 （A）-EGFP表达RIV1细胞转染使用GeneJuice在Geltrex转染后12小时。电镀和馈线后，核转染（B）B-016和A-023（C）程序上形成的RIV1人类iPSCs的殖民地。 （D）稳定EGFP表达人类iPSC的殖民地无处不在的绿色荧光蛋白表达来自GeneJuice。 （E）稳定转染RIV1人的iPS细胞保留构的绿色荧光蛋白表达在胚体分化。