Onze experimentele plan is schematisch diagram in Figuur 1. 1. Groei en bereiding van menselijke neurale stamcellen (NSCs) voor transplantatie De EnStem-A cellijn (EMD Millipore) werd in deze studie gebruikt. NSCs worden routinematig gevalideerd door de fabrikant een hoge mate van expressie van de multipotente markers Nestin en Sox2, en low-level uitdrukking van de pluripotente marker okt-4, samen met de mogelijkheid om te differentiëren in meerdere neuronale fenotypen en een normaal karyotype te behouden na meerdere passages. Onder onze groei-omstandigheden, deze NSCs weergegeven overvloedige uiting van Sox2 en Nestin en behielden hun vermogen om te differentiëren, zoals eerder beschreven 1. NSCs werden gekweekt op poly-L-ornithine (20 ug / ml) en laminine (5 ug / ml) gecoat weefsel cultuur behandeld kolven. Cellen werden gekweekt in neurale groei medium (Millipore), aangevuld met L-glutamine (2 mM) en basische fibroblastgroeifactor (bFGF; 20 ng / ml). Aanhanger monolagen van NSCs waren gepasseerd om de andere dag (1:2) met Accutase als de dissociatie-agent 1. Voor transplantatie studies werden NSCs gebruikt bij passages onder de 10. NSCs werden gelabeld met 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU), door aanvulling van de groei van media met 4 uM BrdU gedurende drie dagen voorafgaand aan de transplantatie. Om te controleren of de etikettering van BrdU-index (dat wil zeggen het percentage van de BrdU-positieve cellen), werden de cellen uitgeplaat op kamer dia's en verwerkt voor BrdU detectie met behulp van standaard immunocytochemische benaderingen. Cellen gebruikt voor transplantatie routinematig vertonen etikettering indices meer dan 90% 2. Als alternatief werden getransplanteerde menselijke stamcellen gedetecteerd met behulp van het menselijk specifieke nucleaire antigen marker (HuNu) 2. Op de dag van de transplantatie, werden Accutase en neurale uitbreiding media voorverwarmd in een 37 ° C waterbad. De cellen werden geplaatst in incubatiemedium (neurale uitbreiding media met 10 uMvan Y-27632) voor een uur. Y-27.632 (ROCK-remmer, EMD-Calbiochem) werd gebruikt om het voortbestaan van NSCs post-transplantatie te verbeteren. Na een uur werd incubatie media verwijderd en werden de cellen behandeld met Accutase gedurende 5 minuten. Na deze korte behandeling toe te voegen een gelijk volume van neurale expansie media om de Accutase te neutraliseren en de cellen stam door middel van een 70 uM cel zeef. Tel de cellen met een hemocytometer en voor te bereiden 1,0 x 10 5 live NSCs per microliter in injectie medium (neurale uitbreiding media met 10 uM van Y-27632, 40 ng / ml bFGF, 20 ng / ml BDNF). De cellen werden opgeslagen in neurale expansie media (zoals beschreven in 1.5) en op ijs bewaard tot het moment van de transplantatie, en dient te worden gebruikt binnen de 6u tot celdood te minimaliseren door langdurige koude-opslag. 2. Radiotherapie – planning van de behandeling en bestraling Gesedeerd athymische naakt rat (s) werden geplaatst in een laboratorium MRI-scanner in buikligging positio n met de schedel bij de superieure end (hoofd eerst). Dit 3 Tesla scanner is ontworpen voor kleine dieren scans. Het kan prachtige weke delen contrast met een hoge ruimtelijke resolutie van cross-sectionele (axiaal) beelden. De scan richt zich op de schedel regio en een set van 22 T2 E60 gewogen opnamen met 0,8 mm dikte afbeelding werden gegenereerd. Deze beelden verlenen van de nodige informatie om de linker en rechter hippocampus te identificeren binnen de hersenen van de rat. Naar aanleiding van de MRI-scan (24), de dieren werden verdoofd [anesthesie cocktail (ketamine, 30 mg / kg, xylazine, 2,5 mg / kg en acepromazine, 1 mg / kg)] en geplaatst in een radiotherapie-oncologie CT-scanner waar een andere cross-sectionele (axiaal) beeld volume was gegenereerd. De rat werd geplaatst in dezelfde of in de buurt in dezelfde positie als voor de MRI-scan en de CT-eenheid werd ingesteld om de schedel regio scan. Een studie van 106 CT-beelden met een dikte van 0,8 mm foto werd gemaakt die werd de CT-planning van de behandeling van gegevens. Planning van de behandelingha "> De MRI-en CT-beeldgegevens werden overgebracht naar de ECLIPSE (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA) planning van de behandeling software via DICOM (Digital-Imaging and Communications in Medicine). ECLIPSE is een verfijnd en in de handel verkrijgbare software die wordt gebruikt in de radiotherapie-oncologie aan model en het ontwerp van de beste bestraling plan voor een patiënt. Het bevat orgaan dichtheid van informatie die wordt gewonnen uit de CT-beeldgegevens en gebruikt om de straling dosisverdeling in het lichaam berekenen. Bedek het dier met behulp van een kleine chirurgische draperen met alleen het hoofd blootgesteld. Plaats het dier kop stevig in het stereotaxisch frame (Benchmark Digital, Leica-myNeurolab) door het invoegen van het oor bars in de uitwendige gehoorgang. Wees uiterst voorzichtig bij het schuiven de punt van het oor bar in de gehoorgang. Plaats de snijtand bar door het inhaken van de rat bovenste snijtanden en het aanpassen van de bar hoogte van de standaard referentiepunt, dan draai neus klem. Midden van de positievan het hoofd tussen de tralies oor met minimale zijwaartse beweging (± 4 mm) om stereotaxische nul te bereiken. De volgende stap in het proces is het bepalen van de bestraling techniek moet worden gebruikt. Intensiteit-gemoduleerde radiotherapie (IMRT) en volumetrisch-gemoduleerde arc therapie (VMAT) in de vorm van RapidArc zijn 2 hoge precisie bestraling technieken die een 6 MV foton beam te gebruiken om een stralingsdosis 3-6 te leveren. Het verschil tussen deze technieken is dat IMRT een dosis levert met behulp van verschillende statische trajecten die elk overeenkomen met een andere richting, maar die samenkomen bij het doelvolume meer geschikt voor zeer kleine doelgroep volumes. RapidArc aan de andere kant, zorgt voor een dosis dynamisch door een of meer bogen gericht op het doelgebied (afb. 4). Ongeacht de levering techniek, informatie over de beoogde dosis, doel conformiteit en dosisbeperkingen om kritische organen moeten worden opgenomen in de optimalisering van de dosis venster in ECLIPSE. Tzijn informatie, samen met orgel volumes wordt gebruikt om op maat van de dosisverdeling, die wordt bereikt door het continu variëren van de bundel demping tijdens de bestraling. Zodra een plan werd gegenereerd, ECLIPSE biedt de berekende dosis gelegd aan de axiale, coronale en sagittale beelden (afb. 5), alsmede in de dosis-volume histogram (DVH) formaat (afb. 6). Het is op dit moment dat het plan moet worden geëvalueerd om te bepalen of deze geschikt is voor levering of verbeterd moet worden. Bestraling Proces Zodra een plan goedgekeurd voor de levering, digitaal gereconstrueerd röntgenfoto (DRR) beelden werden gegenereerd uit de CT-planning van de behandeling van gegevens in Eclipse. Dit zijn orthogonale opnamen gewogen op de botdichtheid van de schedel en andere benige oriëntatiepunten te markeren. Daarna worden behandelplan en DRRs verzonden naar de behandeling van levering computer systeem via DICOM. De levering systeem controleert een Varian Trilogy Linear Accelerator normally gebruikt voor radiotherapie van de mens. De versneller is uitgerust met een 120 computer gestuurde dunne multileaf collimatoren (MLC) en een diagnostische kwaliteit x-ray imaging-systeem opgenomen in de on-board imaging (OBI) systeem. Deze levering systeem laadt de ECLIPSE-specifieke informatie en configureert de collimator parameters in de versneller voor het leveren van de geplande dosis. Op dit punt van de rat werd voorbereid voor bestraling, gesedeerd en bedekt met een papieren deken warm te houden. Na een paar minuten, was de rat, met een deken, maar met zichtbare van de schedel, geplaatst op de behandeltafel in dezelfde positie wordt gebruikt voor de CT-scan te genereren. Dit is een cruciale stap, omdat de nauwkeurigheid is direct gecorreleerd aan nauwkeurigheid in dosering levering. Zodra de rat was goed op de behandeling tafel, is een set van orthogonale X-ray foto's gemaakt met behulp van de Trilogie van de OBI-systeem. Dit zijn hoge resolutie beelden die vervolgens werden gefuseerd tot de ECLIPSE te genererend DRRs het gebruik van de OBI beeldfusie software. De X-ray beelden en DRRs werden digitaal aangepast met behulp van software die informatie op tafel positie verschuivingen die moeten worden gemaakt om co-registratie van de beelden (afb. 7) kunnen waarmaken. Na het lezen van deze informatie en na te gaan of de daaruit voortvloeiende verschuivingen niet per ongeluk te leiden naar elk botsingen tussen het gaspedaal en de behandeling tafel, de computer past de verschuivingen en de behandeling tafel gaat automatisch naar de gewenste positie. Op dit punt, bestraling begint. Het leveren van een 10 Gy dosis met een 6-veld IMRT plan, de straal-on tijd is ongeveer 10 minuten, terwijl een twee-arc ~ RapidArc duurt 3 minuten. Na behandeling levering is voltooid, was de rat uit de behandelkamer en liet te herstellen in een kooi gehouden op een verwarmings-pad. 3. Stereotaxische chirurgie voor intra-hippocampus transplantatie van menselijke stamcellen Eennimals veeteelt en chirurgische voorbereiding Voor deze studie hebben we in dienst twee maanden oude ATN ratten verkregen van National Cancer Institute (stam 0N01 Cr: NIH-rnu). Dieren werden gehouden in steriele kooien en in een temperatuur-en lichte gecontroleerde barrière-A omgeving met 12-h/12-h licht / donker cyclus. Ratten kregen geautoclaveerd voedsel en water ad libitum en zorg is besteed aan ooginfectie te voorkomen met het schoonmaken van de ogen elke week met Vetropolycin oogzalf (West Medical Supply, Arcadia, CA). Voor stereotaxische chirurgie, ratten werden verdoofd met een ip injectie van anesthesie cocktail (ketamine, 30 mg / kg, xylazine, 2,5 mg / kg en acepromazine, 1 mg / kg). Volledige narcose werd geïnduceerd na 10-15 minuten en sedatie werd gecontroleerd met behulp voelbaar reflex (teen knijpen). Indien nodig tijdens de operatie, kan 15-20% van de oorspronkelijke dosis worden gegeven aan voldoende verdoving te behouden. Verwijder de bont van het hoofd met behulp van elektrische tondeuse. Ongeveer200% van de operatie gebied moet worden geschoren om infectie te voorkomen door de haren. Schoon geschoren gedeeltelijk met behulp van providone / jodium (3 keer), gevolgd door 70% alcohol (3 maal) voor de incisie. Stereotaxische chirurgie Stereotaxische instrumenten (digitale monitor en frame), micromotor boren, droog bed sterilisator en controllers moet worden bewaard in een laminaire stroming kap om mogelijke besmetting te voorkomen tijdens operaties procedure in ATN ratten. Een stereotaxische podium met een ingebouwde verwarming pad kan gebruikt worden om de dieren warm te houden tijdens de operatie. We gebruikten 'Kimberly-Clark Safeskin Purple Nitrile Steriel Examen Handschoenen' thoughout de operatie. Deze handschoenen zijn per stuk verpakt in een steriele zak (Cat. Nr. 55093). Daarnaast, chirurg gebruikt 70% alcohol spray om handen te steriliseren tijdens de operatie. Bedek het dier met behulp van een kleine chirurgische draperen met alleen het hoofd blootgesteld. Plaats het dier kop stevig in het stereotaxisch frame (Benchmark Digital, Leica-myNeurolab) door het invoegen van oor bars in de uitwendige gehoorgang. Wees uiterst voorzichtig bij het schuiven de punt van het oor bar in de gehoorgang. Plaats de snijtand bar door het inhaken van de rat bovenste snijtanden en het aanpassen van de bar hoogte van de standaard referentiepunt, dan draai neus klem. Midden van de positie van het hoofd tussen de tralies oor met minimale zijwaartse beweging (± 4 mm) om stereotaxische nul te bereiken. Na deze positionering stappen, van toepassing zijn smerende oogzalf om het drogen te voorkomen en hen te beschermen tegen mogelijke jodium of alcohol morsen. Gebruik deze zalf minstens 2 keer tijdens de operatie. Maak middellijn huidincisie (2 cm) langs de hoofdhuid met steriele scalpel en reinigen met steriele katoenen tip applicator. Voorkom schade aan staart-en nekspieren gebieden. Door gebruik te ontleden oprolmechanisme, houd de periost open en heldere zachte weefsel met behulp van katoenen tip applicator gedoopt in 1% waterstofperoxide (gemaakt in PBS). Om te stoppen met bloeden, onderhouden stevige druk gedurende ten minste 1 min gebruik van katoenen tip applicator of gaas. Oefen een stevige scraping beweging om de schedel en deppen beweging voor de huid schoon tot aan de schedel hechtingen, bregma en lambda zichtbaar waren. Precieze stereotaxische coördinaten, gerelateerd aan de bregma, werden bepaald met behulp van de hersenen van de rat atlas 7. Stamceltransplantatie werd gedaan op vier verschillende locaties voor elk halfrond met de volgende stereotaxische coördinaten: Voorwandinfarct-posterior (AP) 3,0 mm van bregma, medio-laterale (ML) 1,8 mm van de middellijn, en dorso-ventrale (DV) 3,2 mm van het oppervlak van de hersenen. AP, 3,6 mm, ML, 2.5 mm, DV, 3,2 mm AP, 4,2 mm, ML, 3.2 mm, DV, 3.2mm AP, 4,2 mm, ML, 3.2 mm, DV, 3.2mm Zodra de bregma is vastgesteld, moeten alle drie coördinaten (AP, ML en DV) op nul worden gezet op het digitale display / controller (op de digitale stereotaxisch frame). Ga dan naar de precieze transplantatie sites (met behulp van het voorgaande coördinaten markeren) Met een fijne punt marker pen bevestigd aan een kleine sonde houder op het frame. Boor een gat 0,35 mm (nr. 1 / 4 tandheelkundige braam, vanadium hardmetalen boren) door de schedel met behulp van het voetpedaal gecontroleerde micromotor drill (Leica-myNeurolab). Zorg ervoor om schade aan de dura membraan te voorkomen. Als bloeden optreedt tijdens het boren, oefen een stevige druk gebruik van katoenen tip applicator. Wel alcohol of jodium niet van toepassing op de boor site, omdat dit irritatie aan het dier te veroorzaken. Ratten kregen bilaterale intra-hippocampus injecties van een schorsing van NSCs geïnjecteerd in een maximaal volume van 1 pi met behulp van een 5 ul Hamilton micro-injectiespuit (30 gauge). Het precieze aantal cellen binnen dit volume zal variëren afhankelijk van experimentele bijzonderheden. Om dit te bereiken, was de micro bevestigd aan een kleine sonde houder op de stereotaxisch frame. Steek de punt van de naald in de schedel tot het bereiken van het oppervlak van de hersenen (dat wil zeggen hersenvliezen). Op dit punt, de DV-coördinatiete moeten nul op het digitale display / controller, dan voorzichtig steek de naald op de gewenste diepte (DV, 3,2 mm). Wacht een minuut voor het begin van een injectie van de cellen. Injecteer 0,25 pL volume / min (slow release) met behulp van een timer. Zodra een totaal van 1 pi is geïnjecteerd, wacht dan 8 minuten voor terugtrekken naald uit de transplantatie site. Na deze tijd, langzaam terugtrekken van de naald uit de transplantatie site (0,5 mm / min) tot capillaire reflux van de injectie-inhoud terug te verhinderen door de naald track. Volg de stappen 3.2 (jk), voor de overige transplantatie sites (vier per halfrond). Verwijder de huid oprolmechanisme van de schedel en het gebruik van stompe pincet om voorzichtig terug te trekken teruggetrokken huid en 4-5 steriele RVS clips toe te passen met behulp van Autoclips chirurgische hechtingen aanvrager (Leica-myNeurolab). Na het verwijderen van het dier uit het frame, injecteren met analgetische (Buprenorphin, 0,1 mg / kg, sc, elke 12h) en Ringer lactaat-oplossing (5 mL/250 g volwassen ratten, sc). Plaats het dier terug in zijn kooi die moeten worden bijgehouden op een verwarmings-pad. Monitor de dieren totdat het bewuste voordat u terugkeert naar haar belang kamer. Doe een beetje vochtige pellets (dier chow) en transgel in een aparte petrischaal in elk dier kooi. Als alternatief kan DietGel Recovery (ClearH 2 O, Portland, ME) worden gebruikt als een bron van water en voedingsstoffen. Monitor dieren tijdens hun herstel tijd en passen analgesie (buprenorfine 0,02 mg / kg (om 12u voor 2 dagen). Controleer op tekenen van pijn, angst, roodheid of infectie van een operatie site. Apply providone / jodium of neosporin zalf eenmaal per dag (tot 2 -3 dagen) om mogelijke besmetting te voorkomen. Als er tekenen van infectie, pijn of ongemak aanhouden na pijnstiller of een antibiotica behandeling binnen 12 uur na de operatie, raadpleeg dierenarts of dierlijke verzorgend personeel voor verdere assistentie. 4. Representatieve resultaten: iles/ftp_upload/3107/3107fig1.jpg "/> Figuur 1. Schematische weergave van onze experimentele plan. Figuur 2. Fusion of CT (benige anatomie) en MRI (weke delen) beelden in de ECLIPSE-software. Matching van axiale, coronale en sagittale secties zorgen voor de co-registratie van de kritische anatomische kenmerken van de rat hersenen afgeleid van elke beeldvormende modaliteit. Figuur 3. Voorgevormd hippocampus regio van de hersenen. Na beeldfusie, zijn hippocampus en de hersenen met uitzondering van hippocampus geïdentificeerd en contouren axiaal definiëren van specifieke volumetrische regio's voor deze organen. Deze regio's bieden anatomische en volume informatie die nodig is voor het aanpassen van de dosis distributie naar het gewenste doel (s). ure 4 "src =" / files/ftp_upload/3107/3107fig4.jpg "/> Figuur 4. Hoge precisie bestraling opties met intensiteit-gemoduleerde radiotherapie (IMRT) of volumetrisch-gemoduleerde arc therapie (VMAT) in de vorm van RapidArc. Deze technieken leveren 6 MV foton balken hetzij als meerdere statische trajecten die kunnen convergeren op zeer kleine omvang van het doelgebied (IMRT), of dynamisch als een of meer bogen gericht op de doelgroep regio (RapidArc). Figuur 5. ECLIPSE berekende doses gesuperponeerd om de axiale beelden. Aangegeven doseringen zijn voor enkele of dubbele hippocampus bestraling behandeling plannen. Figuur 6. ECLIPSE berekende dosis-volume histogram. Gegevens contrasten het percentage van de bestraalde ten opzichte van de niet-bestraalde hippocampusvolume het kader van de hippocAmpus behandelplan getoond in Fig. 5. Figuur 7. Beeldgeleide rat positionering voor radiotherapie. Orthogonale digitaal gereconstrueerd röntgenfoto (DRR) beelden gegenereerd vanuit de CT-planning van de behandeling van gegevens in ECLIPSE zijn gefuseerd aan orthogonale x-ray beelden van de rat over de behandeling tafel genomen met on-board van de trilogie van de imaging (OBI) systeem. De DRRs worden gewogen op de botdichtheid, dat de schedel en andere benige oriëntatiepunten die co-registratie mogelijk te maken met de OBI beelden hoogtepunten. Matching van deze sets bieden behandeling tafel positie verschuivingen die gemaakt moeten worden om de co-registratie van de CT en de x-ray foto's te bereiken. Figuur 8. Locatie van de getransplanteerde NSCs na stereotaxische operatie. Op een maand na de transplantatie, dieren werden geperfuseerd, hersenen werden sectioned en gekleurd met BrdU (voor getransplanteerde NSCs detecteren) en de teller gekleurd met hematoxyline. De naald track (Nt, rode lijn), geeft de injectie traject dat NSCs gedeponeerd bij de transplantatie-release site (Tr), net onder het corpus callosum (CC) en boven de CA1. Getransplanteerde NSCs toonde uitgebreide migratie van Tr door de host hippocampus (dentate gyrus, DG; dentate hilus, DH, CA1 en CA3 deelgebieden; vergroting x4). Schaalbalk, 200 pm.
