زرع الخلايا الجذعية استراتيجيات من أجل استعادة الضعف المعرفي التي تحدثها العلاج الإشعاعي القحف

هو تخطيطي تخطيطي خطتنا تجريبية في الشكل 1. 1. النمو وإعداد الإنسان الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) للزرع تم استخدام EnStem – A خط الخلية (EMD ميليبور) في هذه الدراسة. يتم التحقق من صحة NSCs بشكل روتيني من قبل الشركة المصنعة لمستويات عالية من التعبير عن nestin علامات multipotent وSox2 ، وانخفاض مستوى التعبير عن علامة المحفزة أكتوبر – 4 ، جنبا إلى جنب مع القدرة على التمايز إلى الظواهر العصبية متعددة والحفاظ على النمط النووي العادي بعد مقاطع متعددة. في ظل ظروف النمو لدينا ، عرض هذه NSCs التعبير وفيرة من Sox2 nestin واحتفظت بقدرتها على التمييز ، كما هو موضح سابقا 1. وقد نمت على NSCs بولي – L – الأورنيثين (20 ميكروغرام / مل) ، وlaminin (5 ميكروغرام / مل) مغلفة زراعة الأنسجة قوارير المعالجة. ونمت الخلايا العصبية في متوسطة التوسع (ميليبور) تستكمل مع الجلوتامين L – (2 ملم) والخلايا الليفية الأساسيةعامل النمو (bFGF و 20 نانوغرام / مل). وكانت ملتصقة passaged monolayers من NSCs كل يوم (1:2) مع accutase كوكيل تفارق 1. للدراسات الزرع ، واستخدمت في NSCs المقاطع أقل من 10. وصفت NSCs مع 5 برومو 2' – deoxyuridine (BrdU) من خلال استكمال وسائل الإعلام مع نمو BrdU ميكرومتر (4) لمدة ثلاثة أيام قبل الزرع. للتحقق من وضع العلامات BrdU مؤشر (أي النسبة المئوية للخلايا BrdU إيجابي) ، وكانت مطلية الخلايا على شرائح الغرفة وتجهيزها للكشف BrdU باستخدام نهج immunocytochemical القياسية. زرع الخلايا المستخدمة لوضع العلامات مؤشرات تظهر بشكل روتيني ما يزيد عن 90 ٪ 2. بدلا من ذلك ، تم الكشف عن زرع الخلايا الجذعية البشرية باستخدام الإنسان علامة محددة مستضد النووي (HuNu) 2. يوم الزرع ، وكانت وسائل الاعلام وتوسيع accutase العصبية قبل تدفئته في حمام ماء C ° 37. تم وضع الخلايا في وسط الحضانة (وسائط التوسع العصبية التي تحتوي على 10 ميكرومترمن Y – 27632) لمدة ساعة واحدة. Y – 27632 تم استخدام (روك المانع ، EMD – Calbiochem) لتحسين بقاء NSCs بعد الزرع. بعد ساعة واحدة ، كانت وسائل الاعلام إزالة الحضانة وعولج الخلايا مع accutase لمدة 5 دقائق. بعد هذا العلاج وجيزة إضافة حجم مساو من التوسع وسائل الاعلام لتحييد العصبية والتوتر accutase الخلايا من خلال مصفاة ميكرومتر الخلية 70. عدد الخلايا مع haemocytometer وإعداد 1.0 × 10 5 NSCs يعيشون في المتوسط ​​لكل ميكروليتر الحقن (وسائط التوسع العصبية التي تحتوي على 10 ميكرومتر من Y – 27632 ، و 40 نانوغرام / مل bFGF ، BDNF نانوغرام / مل 20). تم تخزين الخلايا العصبية التوسع في وسائل الإعلام (كما هو موضح في 1.5) ، وأبقت على الجليد حتى وقت الزرع ، وينبغي أن تستخدم للتقليل من داخل 6H موت الخلايا لفترة طويلة قبل التخزين البارد. 2. العلاج الإشعاعي — التخطيط والعلاج بالأشعة وضعت مخدرا الفئران عارية athymic (ق) في الماسحة الضوئية مختبر التصوير بالرنين المغناطيسي في positio عرضة ن مع الجمجمة في نهاية العلوي (أول رئيس). تم تصميم هذه الماسحة الضوئية تسلا 3 لتفحص الحيوانات الصغيرة. يمكن أن توفر مجموعة رائعة والأنسجة الرخوة على النقيض مع صور عالية القرار المكانية (محوري) مستعرضة. وقد تم توليد الفحص يركز على منطقة الجمجمة ومجموعة من الصور E60 22 T2 المرجحة مع سماكة 0.8 مم الصورة. هذه الصور توفير المعلومات اللازمة لتحديد الحصين اليسار واليمين داخل دماغ الفئران. بعد التصوير بالرنين المغناطيسي (24H) ، كان مخدرا الحيوانات [كوكتيل التخدير (الكيتامين ، 30 ملغ / كلغ ، زيلازين ، 2.5 ملغ / كلغ وآسيبرومازين ، 1 ملغ / كلغ)] ، ووضعها في ماسح الأشعة المقطعية حيث الأورام أخرى مستعرضة (محوري) ولدت حجم الصورة. وضعت الفئران في نفس أو قريبة من نفس الموقف المستخدمة في التصوير بالرنين المغناطيسي وكان تعيين وحدة التصوير المقطعي لمسح المنطقة الجمجمة. ولدت دراسة الصور CT 106 مع 0.8 مم سماكة الصورة التي أصبحت تخطيط العلاج البيانات المقطعية. العلاج التخطيطهكتار "> تم نقل بيانات الصور التصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي لبرنامج علاج التخطيط ECLIPSE (فاريان للأنظمة الطبية ، بالو ألتو ، كاليفورنيا) عن طريق DICOM (التصوير الرقمية والاتصالات في الطب). ECLIPSE هو برنامج متطورة ومتاحة تجاريا المستخدمة في علاج الأورام بالإشعاع لنموذج وتصميم أفضل علاج الإشعاع خطة للمريض. أنه يتضمن معلومات الجهاز الكثافة التي يتم استخراج من البيانات والصور المقطعية المستخدمة لحساب توزيع الجرعات الإشعاعية داخل الجسم. تغطية الحيوانية باستخدام ثنى الجراحية الصغيرة مع رئيس الوحيدة المكشوفة. موقف رئيس الحيوانية بقوة داخل الإطار التجسيمي (رقمي القياسي ، لايكا – myNeurolab) بإضافة أشرطة الأذن في الصماخ السمعي الخارجي. اتخاذ الحذر الشديد عند انزلاق غيض من شريط الأذن في قناة الأذن. وضع شريط القاطعة من خلال اصطياد الفئران في القواطع العلوية وضبط ارتفاع شريط إلى نقطة مرجعية موحدة ، ثم تشديد المشبك الأنف. مركز الموقفمن الرأس بين القضبان الأذن مع الحركة الجانبية ضئيلة (± 4 مم) لتحقيق صفر التجسيمي. الخطوة التالية في العملية هي تحديد تقنية التشعيع لاستخدامه. كثافة التضمين العلاج الإشعاعي (IMRT) وvolumetrically التضمين العلاج القوس (VMAT) في شكل RapidArc هي 2 تشعيع تقنيات عالية الدقة التي تستخدم شعاع الفوتون 6 MV لتقديم جرعة الاشعاع 3-6. الفرق بين هذه التقنيات هو أن يسلم IMRT جرعة باستخدام عدة مسارات ثابتة لكل المقابلة لاتجاه مختلفة ولكنها تلتقي في وحدة التخزين الهدف أكثر ملاءمة لكميات ضئيلة للغاية المستهدفة. RapidArc من ناحية أخرى ، يسلم جرعة حيوي من خلال واحدة أو أكثر من الأقواس التي تركز على المنطقة المستهدفة (الشكل 4). بغض النظر عن أسلوب التسليم ، ومعلومات عن الجرعة المستهدفة ، وبما يتفق والقيود الهدف جرعة للأجهزة الحرجة يجب أن تكون دخلت في إطار الجرعة الأمثل في الكسوف. Tويستخدم معلوماته إلى جانب كميات جهاز لتكييف التوزيع الجرعة ، الذي يتحقق من خلال تغيير باستمرار توهين شعاع خلال التشعيع. مرة واحدة ولدت خطة ، ECLIPSE يوفر جرعة محسوبة فرضه على الصور ، المحوري الاكليلية والسهمي (الشكل 5) وكذلك في حجم الجرعة والشكل (DVH) الرسم البياني (الشكل 6). وهو في هذه النقطة عندما يجب أن يتم تقييم الخطة لتحديد ما إذا كانت مناسبة للتسليم أو يحتاج إلى تحسين. عملية التشعيع مرة واحدة وتمت الموافقة على خطة للتسليم ، تم إنشاؤها رقميا بناؤها صورة شعاعية (DRR) صور من بيانات التخطيط CT العلاج في الكسوف. هذه هي الصور متعامد مرجح على كثافة العظام لتسليط الضوء على معالم العظمية في الجمجمة وغيرها. بعد ذلك ، يتم إرسالها خطة العلاج وDRRs إلى الكمبيوتر عبر نظام معالجة التسليم DICOM. نظام التسليم يسيطر على مسرع الخطي ثلاثية فاريان نيستخدم العلاج الإشعاعي للormally البشر. وقد تم تجهيز المسرع مع 120 جهاز للرقابة collimators multileaf رقيقة (حركة تحرير الكونغو) ، ونظام الجودة التشخيص والتصوير بالأشعة السينية إدراجها ضمن النظام على متن (بى) التصوير. هذا النظام تسليم تحميل المعلومات ECLIPSE محددة ويعيد تكوين المعلمات ميزاء في التسريع لتقديم الجرعة المقررة. عند هذه النقطة كان على استعداد للفأر لأشعة ، مخدرا ومغطاة ببطانية ورقة لإبقائه دافئا. بعد بضع دقائق ، وضعت الفئران ، مع بطانية ولكن مع الجمجمة المكشوفة ، وعلى طاولة العلاج في موقف نفسها التي استخدمت لتوليد الاشعة المقطعية. هذا هو خطوة حاسمة لأنه يرتبط ارتباطا مباشرا الى دقة الموقف الدقة في إيصال الجرعة. بمجرد وضعه على الفئران بشكل صحيح على طاولة العلاج ، ويتم اتخاذ مجموعة من صور الأشعة السينية المتعامدة باستخدام النظام ثلاثية لبى. هذه الصور ذات الدقة العالية التي كان تنصهر بعد ذلك إلى توليد ECLIPSEد DRRs باستخدام الانصهار صورة OBI البرمجيات. وجرى الربط رقميا صور الأشعة السينية وDRRs باستخدام البرمجيات التي توفر معلومات عن تحولات موقف الجدول الذي يجب أن تبذل لتحقيق المشاركة في تسجيل الصور (الشكل 7). بعد استعراض هذه المعلومات والتحقق من أن التحولات الناتجة عن غير قصد لا تؤدي إلى أي اصطدام بين التسريع والجدول العلاج ، وينطبق الكمبيوتر التحولات وجدول العلاج يتحرك تلقائيا إلى الموضع المطلوب. عند هذه النقطة ، تبدأ التشعيع. لتقديم جرعة 10 غراي مع خطة IMRT 6 الميدانية ، والحزم في الوقت المحدد هو حوالي 10 دقيقة في حين أن اثنين قوس RapidArc يأخذ ~ 3 دقائق. بعد تقديم العلاج الكامل ، وإزالة الفئران من غرفة العلاج ، وسمح لاسترداد عقد في قفص أبقى على وسادة التدفئة. 3. التجسيمي جراحة لزرع الحصين داخل الخلايا الجذعية البشرية Animals تربية وإعداد الجراحية لهذه الدراسة ، وظفت نحن اثنان الفئران الشهر ATN القديمة المكتسبة من المعهد الوطني للسرطان (سلالة 0N01 الكروم : NIH – rnu). بقيت الحيوانات في الأقفاص معقمة والاحتفاظ بها في درجة الحرارة والضوء للرقابة حاجز – A مع البيئة ضوء 12-h/12-h / دورة الظلام. وقدمت الفئران تعقيمها الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية والحرص على منع العدوى عن طريق تنظيف العين عيون كل أسبوع مع مرهم العين Vetropolycin (غرب التموين الطبي ، أركاديا ، كاليفورنيا). لجراحة التجسيمي ، تم تخدير الفئران مع حقنة تخدير IP من الكوكتيل (الكيتامين ، 30 ملغ / كلغ ، زيلازين ، 2.5 ملغ / كلغ وآسيبرومازين ، 1 ملغ / كلغ). وكان المستحث التخدير الكامل بعد رصد 10-15 دقيقة وباستخدام التخدير منعكس اضح (قرصة أخمص القدمين). إذا كان ذلك مطلوبا أثناء الجراحة ، يمكن إعطاء 15-20 ٪ من الجرعة الأصلية للحفاظ على ما يكفي من التخدير. إزالة الفراء من الرأس باستخدام مقصات كهربائية. تقريباوينبغي أن يحلق 200 ٪ من مساحة لعملية جراحية لمنع العدوى عن طريق الشعر. النظيفة جزء حلق به providone / اليود (3 مرات) ، يليه الكحول 70 ٪ (3 مرات) قبل شق. التجسيمي جراحة يجب أن تبقى التجسيمي الصكوك (الرقمية ورصد الإطار) ، حفر micromotor وجافة معقمة السرير وتحكم في تدفق رقائقي غطاء للوقاية من العدوى المحتملة أثناء إجراء عملية جراحية في الفئران ATN. ويمكن استخدام مرحلة التجسيمي مع سادة التدفئة المضمنة للحفاظ على الحيوانات دافئة أثناء الجراحة. استخدمنا "كيمبرلي كلارك بيربل قفازات نيتريل امتحان Safeskin العقيمة" thoughout الجراحة. معبأة فرديا هذه القفازات في كيس معقم (الفئة رقم 55093). بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم الجراح 70 ٪ رذاذ الكحول لتعقيم اليدين أثناء الجراحة. تغطية الحيوانية باستخدام ثنى الجراحية الصغيرة مع رئيس الوحيدة المكشوفة. موقف رئيس الحيوانية بقوة داخل الإطار التجسيمي (رقمي القياسي ، لايكا – myNeurolab) عن طريق إدراج با الأذنالتمرير في الصماخ السمعي الخارجي. اتخاذ الحذر الشديد عند انزلاق غيض من شريط الأذن في قناة الأذن. وضع شريط القاطعة من خلال اصطياد الفئران في القواطع العلوية وضبط ارتفاع شريط إلى نقطة مرجعية موحدة ، ثم تشديد المشبك الأنف. مركز منصب رئيس الأذن بين القضبان مع الحركة الجانبية ضئيلة (± 4 مم) لتحقيق صفر التجسيمي. باتباع الخطوات التالية لتحديد المواقع ، وتطبيق مرهم التشحيم لمنع جفاف العين وحمايتها من اليود ممكنا أو انسكابات الكحول. استخدام هذا المرهم على الأقل 2 مرات خلال الجراحة. يميل جعل خط الوسط شق الجلد (2 سم) على طول فروة الرأس باستخدام مشرط معقم ونظيف باستخدام القطن المعقم قضيب. تجنب الضرر في الذيلية والرقبة المناطق العضلات. باستخدام مبعاد تشريح ، عقد سمحاق مفتوحة والأنسجة الرخوة واضحة باستخدام قضيب يميل القطن مغموسة في 1 ٪ بيروكسيد الهيدروجين (المحرز في برنامج تلفزيوني). لوقف النزيف ، والحفاظ على ضغط ثابت لا يقل عن 1 ميلن استخدام القطن أو الشاش يميل قضيب. تطبيق اقتراح إلغاء شركة لتنظيف الجمجمة اللمس والحركة للبشرة حتى الغرز الجمجمة ، وامدا bregma كانت واضحة. وتم تحديد الإحداثيات الدقيقة التجسيمي ، المشار إليه إلى bregma ، وذلك باستخدام الفئران أطلس الدماغ 7. وقد تم زرع الخلايا الجذعية في أربعة مواقع منفصلة لكل نصف الكرة الأرضية باستخدام الإحداثيات التالية التجسيمي : Anterio الخلفي (ا ف ب) 3.0 ملم من bregma ، ميديو – الوحشي (ML) 1.8mm من خط الوسط ، وظهري بطني – (DV) 3.2mm من سطح الدماغ. ا ف ب ، 3.6 مم ؛ ML ، 2.5 مم ؛ DV ، 3.2 ملم ا ف ب ، 4.2 مم ؛ ML ، 3.2 مم ؛ DV ، 3.2mm ا ف ب ، 4.2 مم ؛ ML ، 3.2 مم ؛ DV ، 3.2mm مرة واحدة وقد تم التعرف على bregma ، ينبغي ركزت جميع الإحداثيات الثلاثة (أ ب ، و ML و DV) على وحدة تحكم العرض الرقمي / (على تأطير التجسيمي الرقمية). ثم المضي قدما لوضع علامة على المواقع زرع دقيقة (باستخدام الإحداثيات السابقة) مع غرامة نقطة القلم علامة تعلق على حامل مسبار صغير على الإطار. حفر حفرة 0.35mm (رقم لدغ الأسنان 1 / 4 ، كربيد الحفر الفاناديوم بت) من خلال الجمجمة باستخدام دواسة القدم حفر micromotor رقابة (لايكا – myNeurolab). الحرص على منع حدوث تلف في غشاء الجافية. إذا كان النزيف يحدث أثناء الحفر ، والضغط الثابت باستخدام قضيب يميل القطن. لا تنطبق الكحول أو اليود في موقع الحفر ، حيث أن هذا سوف يسبب تهيج للحيوان. تلقت الفئران الثنائية داخل الحصين حقن تعليق NSCs حقنه في حجم الحد الأقصى من 1 ميكروليتر باستخدام 5 ميكرولتر microsyringe هاميلتون (30 مقياس). والعدد الدقيق للخلايا داخل هذا الحجم تبعا لخصوصيات التجريبية. لإنجاز هذا ، كان يعلق microsyringe إلى حائز مسبار صغير على الإطار التجسيمي. بعناية إدراج رأس الإبرة في الجمجمة حتى تصل إلى سطح الدماغ (السحايا أي). في هذه النقطة ، DV التنسيقيوينبغي أن ركزت الشركة المصرية للاتصالات على وحدة تحكم العرض الرقمي / ، ثم أدخل الإبرة برفق إلى عمق المطلوب (DV ، 3.2 ملم). انتظر 1 دقيقة قبل الشروع في أي حقن الخلايا. ضخ 0.25 حجم ميكرولتر / دقيقة (الإفراج البطيء) باستخدام جهاز توقيت. مرة واحدة يتم حقن ما مجموعه 1 ميكرولتر ، انتظر 8 دقيقة قبل التراجع إبرة من موقع الزرع. بعد هذا الوقت ، يتراجع ببطء الإبرة من موقع الزرع (0.5 مم / دقيقة) لمنع ارتداد الشعرية محتويات الحقن مرة أخرى خلال المسار الإبرة. اتبع الخطوات من 3.2 (كيه) للمواقع زرع المتبقية (4 في نصف الكرة الأرضية). مبعاد إزالة الجلد من الجمجمة واستخدام ملاقط لفظة برفق الجلد تراجع الى الوراء وتطبيق 4-5 مقاطع غير القابل للصدأ معقمة باستخدام Autoclips خياطة جراحية مطبق (لايكا – myNeurolab). بعد إزالة الحيوان من الإطار ، مع حقن مسكنة (Buprenorphin ، 0.1 ملغ / كلغ ، SC ، كل 12H) وLactated حل رينغر (5 ز mL/250 الكبار الفئران ، SC). مكان ظهر الحيوان في قفصه التي يجب أن تبقى على وسادة التدفئة. مراقبة الحيوانات حتى يصبح واعيا قبل أن تعود إلى غرفة حصتها. مكان مبلل بعض الكريات (طعام الحيوانات) وtransgel في طبق بتري منفصلة في كل قفص الحيوانات. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام DietGel الاسترداد (ClearH 2 O ، وبورتلاند ، ME) كمصدر للمياه والمواد المغذية. رصد الحيوانات خلال فترة شفائهم وتطبيق تسكين (البوبرينورفين 0.02 مغ / كغ (كل 12H ل 2 يوما). التحقق من وجود علامات الألم والضيق ، احمرار أو التهاب في موقع الجراحة. providone تطبيق / اليود أو مرهم neosporin مرة واحدة يوميا (حتى 2 أيام -3) للوقاية من العدوى المحتملة. إذا كان أي علامات الألم ، وتستمر العدوى أو استغاثة بعد العلاج بالمضادات الحيوية أو مسكن في غضون 12 ساعة من الجراحة ، واستشارة الطبيب البيطري أو الحيوان موظفي الرعاية لمزيد من المساعدة. 4. ممثل النتائج : iles/ftp_upload/3107/3107fig1.jpg "/> الشكل 1. تمثيل تخطيطي من خطتنا التجريبية. الشكل 2. فيوجن من CT (تشريح عظمي) والتصوير بالرنين المغناطيسي (الأنسجة الرخوة) صور من داخل برنامج ECLIPSE. مطابقة للأقسام المحوري ، الاكليلية والسهمي تسمح للتسجيل المشترك من السمات التشريحية الحرجة للدماغ الفئران المستمدة من كل طريقة التصوير. الشكل 3. أحيط مناطق قرن آمون في الدماغ. بعد اندماج الصورة ، ويتم تحديد الحصين والدماغ الحصين واحيط باستثناء تحديد المناطق محوريا الحجمي محددة لهذه الأجهزة. هذه المناطق التشريحية وتوفير المعلومات اللازمة لتعديل حجم توزيع الجرعة إلى الهدف المنشود (ق). لدى عودتهم 4 "SRC =" / files/ftp_upload/3107/3107fig4.jpg "/> الشكل 4. عالية الدقة باستخدام أشعة خيارات كثافة التضمين العلاج الإشعاعي (IMRT) أو volumetrically التضمين العلاج القوس (VMAT) في شكل RapidArc. هذه التقنيات تسليم 6 MV فوتون أشعة إما ثابت مسارات متعددة يمكن أن تتلاقى على وحدات التخزين الهدف صغيرة جدا (IMRT) ، أو بشكل حيوي واحد أو أكثر من الأقواس التي تركز على المنطقة المستهدفة (RapidArc). الشكل 5. جرعات محسوبة ECLIPSE فرضه على الصور المحوري. الجرعات المبينة هي للمفرد أو مزدوج الحصين خطط المعالجة بالإشعاع. الشكل 6. ECLIPSE تحسب الجرعة حجم الرسم البياني. بيانات يتناقض نسبة المشع في مقابل حجم غير المشع الحصين تحت hippoc واحدampus خطة العلاج هو مبين في الشكل. 5. الرقم 7. وضع صورة الفأر موجهة من أجل العلاج الإشعاعي. وتنصهر متعامد رقميا بناؤها صورة شعاعية (DRR) الصور الناتجة عن تخطيط البيانات المقطعية العلاج في ECLIPSE إلى صور الأشعة السينية المتعامدة من الفئران على طاولة العلاج التي اتخذت مع ثلاثية على متن نظام (بى) التصوير. يتم ترجيح DRRs على كثافة العظام التي تسلط الضوء على معالم العظمية في الجمجمة وغيرها مما يسهل التعاون مع لوحات تسجيل بى. التوفيق بين هاتين المجموعتين توفير العلاج تحولات الموقف الجدول الذي يجب أن تبذل لتحقيق المشاركة في تسجيل الصور المقطعية والأشعة السينية. الرقم 8. مكان NSCs عقب خضوعه لجراحة زرع التجسيمي. وكانت العقول في شهر 1 بعد الزرع ، وperfused الحيوانات ، sectioneود. ملطخة BrdU (للكشف عن NSCs زرع) والملون مواجهة مع الهيماتوكسيلين المسار الإبرة (NT ، خط أحمر) ، يشير إلى مسار الحقن التي أودعت في موقع NSCs زرع اطلاق سراح (TR) ، أسفل الجسم الثفني (CC) ، وفوق CA1. وأظهر زرع NSCs الهجرة واسعة من جميع أنحاء آر الحصين المضيف (التلفيف المسنن ، DG ؛ نقير المسنن ، DH ؛ CA1 CA3 والفروع ؛ X4 التكبير). شريط النطاق ، 200 ميكرون.