重组DNA和蛋白质复合物，用原子力显微镜的可视化

1。准备的DNA和蛋白质进行成像污染物的样本分离生物分子成像和地方在一个合适的缓冲溶液。成像的蛋白可能纯化使用液相色谱仪 6，免疫吸附其次是 1,2抗体和沉淀，去除或Profinity确切的纯化和标记清除（ 图 2A ）。隔离的DNA分子成像小量纯化（ 图2B）。 确认成像采用SDS – PAGE和免疫印迹的蛋白质样品的组成和纯度。对于DNA，确认序列，完成了限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳和纯洁性。 孵育样品在原子力显微镜的吸附缓冲，促进坚持以云母样品。对于蛋白质样品，10毫米HEPES缓冲液可用于。以及可能会增加额外的低离子强度的盐或其他辅助因子。对于DNA样本，包括一个二价阳离子（如镁2 +或Ni 2 +的 ），以促进吸附在云母基片。一个合适的Mg 2 +含缓冲的DNA是10毫米的Tris，pH值7.5，10毫米氯化钠，2毫米氯化镁2 3。另一种Ni 2 +的缓冲是10毫米的HEPES，pH为6.8，10毫米NiCl 2。 稀释样品的吸附缓冲5微克/毫升的浓度。轻轻地混合。而显微镜正准备冰商店。 2。安装原子力显微镜探针液体细胞探头支架放置到相应的悬臂安装扩展坞。 找到长，厚的尖锐氮化杆（SNL）探针悬臂（简称为“B”悬臂）用于成像。小心地转移到液体细胞探头支架，确保针尖保持直立。技术说明：必须格外小心支付而探头在传输过程中从任何高度下降，可能会损坏或破坏悬臂或提示。一个microlever SNL（MSNL）探头可以用来作为替代的SNL探头。 从扩展坞中取出探头支架和光显微镜下检查，以确保它是完整的和正确地固定在液体中的细胞探头支架悬臂。 拧紧滚花头紧固螺钉，小心地从仪器衔接大会的原子力显微镜头。技术说明：必须格外小心，同时操纵原子力显微镜头，甚至在短距离（例如，如果不正确地坐在燕尾大会）下降，可能造成实质损害。 反转的原子力显微镜头和液体的细胞探头支架牢牢地推到了四针，在原子力显微镜头的基础。小心地返回到仪器衔接大会的原子力显微镜头。松开滚花头紧固螺钉固定到仪器原子力显微镜头。 3。定位悬臂尖端，结合激光，并调整光电探测器使用原子力显微镜的仪器软件，找到板载光镜下的移动旋钮在悬臂的针尖。调整显微镜的照明，如果有必要提高识别提示。携带到悬臂尖端仪器软件上显示的十字线接近结束。 光学控制器上的软件的向上和向下箭头的调整，使悬臂尖端成为关注的焦点。使用慢（S）或中等（M）的速度，同时调整光学。 将悬臂尖端的激光利用激光调节旋钮。移动调节旋钮，直到红色激光点内的白色照明点。跟踪沿悬臂使用锯齿形图案的胳膊，直到激光定位悬臂尖端。正确对齐，会出现一个强烈的反射点的原子力显微镜头的前窗。 中心的光电探测器，通过调整探测器上的原子力显微镜头旋钮。仪器软件的探测器显示的十字线，这将调整激光点。所观察到的信号的总和应约4-6。 4。定位原子力显微镜头和调整悬臂将新鲜剥离的云母片磁化样品支架上的原子力显微镜的持有人板上面附着一个金属原子力显微镜标本光盘。此设置将被用于成像在第1步准备的DNA或蛋白质样品前位置的原子力显微镜头。 技术说明：磁化的样品架和液体细胞探头支架紧固机制和探头持有人比其他样品厚。如果目前有云母样品持有人大会和原子力显微镜头的不足之间的间隙，移动的原子力显微镜头几次选择仪器软件的退出图标。 旋转原子力显微镜的持有人定位是最初的成像板，使标本光盘。确保云母基板的原子力显微镜头下的中心。 对移动的原子力显微镜头云母标本的焦点表面控制仪器的软件光盘的表面。选择在Z电机中（M）的速度，并继续对表面的原子力显微镜头，直到约2毫米以上云母。此时，转用慢（S），Z电机的转速，以避免突然之间的探头和表面（称为崩溃​​的提示）接触。 继续移动探针接近云母基材表面，特色鲜明，直到在云母表面或尖反射重点。表面和尖端的反映，使用“的重点是：”焦平面仪器软件的图标之间切换。 选择仪器软件的调整图标和调整的悬臂。推荐的SNL和MSNL悬臂探针的共振频率为20-60千赫。选择一个5％的峰值偏移。技术说明：充足的悬臂调整是必需的足够的样品成像。 5。成像云母样品表面参与到云母表面的探头。设置初始扫描大小为10微米，扫描速度为1 Hz。积分增益和比例增益，可以初步设定为0.2和0.4，分别为。根据需要调整，为了跟踪和追溯扫描大致重叠收益。降低的幅度设定值将增加探头和云母之间的相互作用，并确保参与。 捕捉10微米领域的完整的扫描图像。减少扫描尺寸为5，1，和0.5微米，捕捉每一个领域的完整图像。根据需要调整增益和扫描速度。捕获云母表面的图像提供的DNA和含蛋白质的样品进行比较的一个基准。 放开探头单上脱离仪器软件图标点击。 6。成像生物分子的利益轻轻地混合在第1步准备的DNA或蛋白质样品，并准备加载到成像的云母表面。混合45新鲜的吸附缓冲液（最终样品的浓度为0.5微克/毫升）5μL准备好的样品。 小心地添加50μL的0.5微克/毫升含有生物分子溶液直接到云母表面。不移动探头或原子力显微镜头，并确保样品溶液（但不吸管尖）与探头接触。 暂停5分钟，让样品中的生物分子坚持以云母表面。 在5分钟后，一个额外的吸管50-100吸附缓冲液注入液相细胞探头支架结束，小心不要触摸探头，原子力显微镜头，或用吸管尖云母。这将形成一个半月板，并允许在流体中的AFM轻敲模式成像。图3显示了流体细胞，悬臂式，样品，样品架，和半月板的最后安排。 调整光探测器，并在必要时重新调整激光的悬臂。技术说明：查看探针和激光准直是复杂的，由于加入样品缓冲探头支架引起的衍射图样。悬臂式手动重新调整，如果需要的话。 再搞探头使用的仪器软件。调整垂直偏转，积分增益，并在必要时的比例增益。这将开始重新成像的过程中，云母节前夕加样和捕捉图像扫描。 增加扫描尺寸（500 NM – 10微米），以确定感兴趣区域。变焦和0.5 Hz的频率降低扫描速度，以提高图像分辨率一旦成像完成后，脱离探针仪器上的软件选择退出图标几次。确保足够的间隙之间的原子力显微镜头和液体细胞或标本盘拆装前的标本光盘。 用蒸馏水彻底冲洗液细胞的探头支架和标本光盘，以防止残留的吸附缓冲蒸发形成的盐晶体。用压缩空气干燥。 7。代表性的成果： 图4中的原子力显微镜图像的例子。云母基片（一）提供了一个分子平坦的表面上的DNA和蛋白质可以吸附。前生物分子样品的成像云母提供了一个消极的成像噪声的控制和评估。它还提供了一个悬臂适当的调整和随后的样品成像会取得成功的保证水平。双链质粒DNA（B，D），推定超，很容易确定其不对称的外观和以前不起眼的云母基板上沉积的统一。谨慎的粒径（C，E的）的蛋白复合物，也从云母基板唯一区别的。粒度的差异表明样本异质性，可有用的逼近蛋白复合物的化学计量学或生化活性。一般的对角线形状和亲一致的方向在C组中观察到的蛋白颗粒是一种成像神器，如蛋白质会预计在云母基板上以随机方式面向。所观察到的神器可能的原因是一个物理的提示异常或原子力显微镜成像在过于快速的扫描速率。虽然提示卷积（ 如图1B所示）防止绝对长度测量计算，在X和Y轴（Z轴）高度测量和相对的X和Y的测量，可还是估计的成像生物分子的生物物理特性作出了有益的。 图1：轻敲模式原子力显微镜（AFM）的原理介绍。一，在显微镜。在悬臂年底是一个尖锐的的提示，振荡向上和向下，因为它在云母基板的表面进行扫描，生物分子复合体吸附。由于扫描仪在X和Y方向移动，激光束反射到一个位置敏感的光电二极管探测器地图提示动作，因为它传递坐在上的生物分子复合物，垂直（Z）距离，从后面的悬臂云母。 B.在提示卷积造成的X和Y方向的图像失真。传统的氮化硅针尖的名义半径大于颗粒成像，针尖接触样品的边缘，因为它穿越表面。在影像出现在X和Y方向的大颗粒，但没有Z轴方向的提示卷积结果。提示使用一个较小的名义刀尖半径的，可以减少这种效应。 图2：immunoadsorbed蛋白质和DNA样品制备的插图。一，发行immunoadsorbed的GR•HSP70蛋白的单克隆抗体（mAb）蛋白A琼脂糖凝胶（PAS）的颗粒复杂。孵化与含有单克隆抗体的抗原表位肽的immunopellet，将有利于颗粒GR•HSP70蛋白复合物的释放，使复杂的收集上清，可视化的AFM。乙，DNA的制备，原子力显微镜成像，需要使用一个二价阳离子吸附缓冲。二价阳离子增加云母基板上的DNA的亲和力。 图3：最后的安排的原子力显微镜头，液体细胞探头支架，样品，标本持有人，和缓冲区半月板。一，护理必须采取沉积到云母基板时，样品和额外的缓冲区，以避免吸管尖和原子力显微镜头，液体通话，和云母基板之间的身体接触。 B，A的放大倍率从标本光盘缓冲区半月板跨度液体细胞探头支架。 图4：云母基板的原子力显微（一），2xGal4 – 2xGRE luciferease质粒DNA（B，D），和GR•HSP70蛋白复合物在缓冲溶液中（C，E的） 。云母，与DNA和蛋白质的可视化控制图像。遗传资源•HSP70蛋白复合物的制备与HSP70和抗体珠颗粒释放使用一个单克隆抗体竞争性抗体（如图2A所示），然后催芽遗传免疫吸附。 DNA的制备按常规质粒小量。面板A，B和C相当于放大倍率（比例尺= 200 nm）的一样，都是面板D和E（比例尺= 40纳米）。